丁登峰,高 翔,張 旭,劉 旭,孫彩顯,張 麗,張連峰,*

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100021. 2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京市人類(lèi)重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心, 北京 100021)

瘦素受體(leptin receptor, LEPR) 是瘦素(leptin) 的功能性受體,Leptin/LEPR 軸能激活JAK2-STAT3、PI3K 和 AMPK 等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而發(fā)揮抑制食欲、促進(jìn)能量消耗,減少脂肪含量調(diào)節(jié)體重的功能[1-3]。 LEPR 的突變是嚙齒類(lèi)動(dòng)物和人類(lèi)肥胖/糖尿病突變的基礎(chǔ)[4]。 LEPR 缺失的db/db小鼠(diabetes mouse),是典型的2 型糖尿病模型,能夠反映肥胖、糖耐量進(jìn)行性惡化、高血壓和高脂血癥等人類(lèi)疾病的表型[5-6]。 LEPR 的突變的大鼠(zucker diabetic fatty rats, ZDF)也表現(xiàn)高胰島素血癥、高脂血癥和高血壓,并表現(xiàn)出糖耐量減低的2 型糖尿病癥狀[7-8]。 瘦素受體敲除大鼠表現(xiàn)為過(guò)度肥胖、多飲、多食、血糖高、對(duì)葡萄糖不耐受、高胰島素血癥和血脂異常[9-10]。

Leptin/LEPR 軸不僅與能量代謝有關(guān),Leptin 和LEPR 在被發(fā)現(xiàn)腦中具有表達(dá)[11]。 那么,Leptin/LEPR 是否參與腦中免疫調(diào)節(jié)的問(wèn)題,目前研究很少。 已知無(wú)論是在leptin 突變的 ob/ob 和 LEPR 突變的 db/db 小鼠,都有明顯的腦損傷和神經(jīng)炎癥[12-13]。 小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞,與腦損傷與神經(jīng)炎癥有關(guān)[14-15],但目前瘦素受體與小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)炎癥的研究報(bào)道的很少,這將是本文的切入點(diǎn),利用瘦素受體敲除大鼠闡述LEPR 與小膠質(zhì)細(xì)胞之間的聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

LEPR 全身敲除大鼠(LEPR-/-)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所遺傳疾病模型工程平臺(tái)培育,LEPR-/-繁育過(guò)程中所需的8 周齡SPF 級(jí)SD大鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供[SCXK(京)2019-0011]。 雌雄各 10 只,體重在200～400 g 之間,按照雌雄比例 1 ∶1進(jìn)行合籠繁育。 實(shí)驗(yàn)所需大鼠均飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所屏障環(huán)境動(dòng)物房[SYXK(京)2019-0014],飼養(yǎng)間溫度(23±2)℃,12/12 h 明暗交替照明,動(dòng)物自由飲水及采食。 本實(shí)驗(yàn)涉及到的所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物程序均通過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC ZLF18003)的批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遵循了3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12 培養(yǎng)基、Neurobasal Media 神經(jīng)元培養(yǎng)基、DPBS 緩沖液和Fetal Bovine Serum 胎牛血清購(gòu)自于美國(guó) Gibco 公司;FITC-Dextran 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;Aβ(1-40)購(gòu)自于美國(guó) AnaSpec 公司;TRIzol 購(gòu)自于美國(guó)賽默飛公司;一抗leptin receptor、PI3K 和 AKT 購(gòu)自于英國(guó) Abcam 公司;RT-PCR 試劑盒購(gòu)自于日本TaKaRa 公司;無(wú)水乙醇和異丙醇購(gòu)自于北京化工廠有限責(zé)任公司;DNA 提取試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;兔二步免疫組化試劑盒和DAB 染色液購(gòu)自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自于美國(guó)康寧公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司;激光共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡購(gòu)自于德國(guó)萊卡公司;離心機(jī)和移液器購(gòu)自于德國(guó)艾本德公司;6 孔板、24 孔板細(xì)胞爬片和10%福爾馬林固定液購(gòu)自于北京索萊寶科技有限公司;qPCR 引物購(gòu)自于北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司; 生物安全工作臺(tái)購(gòu)自于蘇州設(shè)備凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

LEPR+/-交配,選取同窩陰性對(duì)照(LEPR+/+)和敲除純和子(LEPR-/-) 1 周齡新生 SD 幼鼠各20只,低溫麻醉處死,用高壓過(guò)的手術(shù)器械取出大腦置于含DPBS(Gbico)的圓皿中清洗,去除腦組織上面的腦膜和血塊,然后在1 mL 胰酶中剪碎,再加入2 mL 胰酶轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管置于溫箱中消化8 min,加10 mL 培養(yǎng)基混勻中和胰酶消化,將上清過(guò)濾到新的 15 mL 離心管中,1500 r/min,離心5 min,倒掉上清,保留管底沉淀,用1 mL 培養(yǎng)基吹打混勻后轉(zhuǎn)移至75 cm2培養(yǎng)瓶中[16]。 將獲得的細(xì)胞放在在含5% CO2, 37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱里常規(guī)培養(yǎng)7～14 d左右。 上述是三種細(xì)胞的共同培養(yǎng)步驟,但是培養(yǎng)基和分離方式不同,其中原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基是含10%胎牛血清,1%非必需氨基酸,1%青霉素/鏈霉素和1%的谷氨酰胺的DMEM-F12 培養(yǎng)基(Gbico),上層細(xì)胞是小膠質(zhì)細(xì)胞,37℃搖床,200 r/min 振蕩分離2 h 即可獲得,下層貼壁細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞,用胰酶消化即可獲得;原代神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)基是含有10% B27,1%非必需氨基酸,0.5%青霉素/鏈霉素和1%的谷氨酰胺的Neurobasal Media 無(wú)血清培養(yǎng)基(Gbico),其他細(xì)胞在此環(huán)境中無(wú)法存活,獲得的細(xì)胞即為神經(jīng)元細(xì)胞。

1.3.2 小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬的免疫熒光觀察

在24 孔板中放置多聚賴(lài)氨酸包被過(guò)的爬片(Acmec),接種原代小膠質(zhì)細(xì)胞,接種密度一般為60%～70%,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h, 隨后換無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12 h,隨后分別給予吞噬示蹤劑FITC-Dextran(Sigma)和 Aβ(1-40)(AnaSpec),分別繼續(xù)孵育 2 h 和 3 h,暗光處 PBS 洗 3 次,每次 3 min,4%多聚甲醛(碧云天)固定20 min,PBS 洗3次,每次3 min,DAPI(中杉金橋)封片,雙光子顯微鏡(Leica)觀察小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬。 每組30 個(gè)視野,根據(jù)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬的熒光強(qiáng)度用Image J 軟件計(jì)算每個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力。

1.3.3 LPS 誘導(dǎo)致死性和腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)分析

選取8 周齡 LEPR+/+和 LEPR-/-大鼠,分為 4組,每組12 只大鼠,雌雄各6 只,雄性大鼠體重在200～450 g 之間,雌性大鼠體重在 200 ～350 g 之間,各個(gè)組分別為L(zhǎng)EPR+/+組,LEPR-/-組,LEPR+/++LPS組,LEPR-/-+LPS 組。 LEPR+/+組和 LEPR-/-組腹腔注射0.2 mL PBS;LEPR+/++LPS 組和LEPR-/-+LPS組,根據(jù)體重分別腹腔注射LPS(Sigma),注射劑量為0.5 mg/100 g。 隨后每1 h 觀察大鼠情況,LPS 處理的大鼠瀕臨死亡時(shí)麻醉取材,PBS 組大鼠同時(shí)間點(diǎn)取材。 48 h 未死大鼠安樂(lè)死取材。 統(tǒng)計(jì)LPS 誘導(dǎo)致死的數(shù)量,并作生存曲線。 大腦組織福爾摩林固定,按一般病理程序石蠟包埋,制備 5 μm 切片[17],用 1 ∶100 稀釋的抗 IBA-1 單克隆抗體(Abcam)標(biāo)記腦組織的小膠質(zhì)細(xì)胞,用兔二步法免疫組化試劑盒標(biāo)記二抗,DAB 顯色(中杉金橋),Pannoramic 掃描儀掃描(3DHISTECH),觀察并統(tǒng)計(jì)小膠質(zhì)細(xì)胞的不同活化形態(tài)。

1.3.4 蛋白提取與蛋白免疫印跡

收集LEPR+/+和LEPR-/-大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞,在細(xì)胞蛋白裂解液Pierce TM RIPA Buffer 中,加入1%PMSF,1%磷酸酶抑制劑和1%蛋白酶抑制劑(Thermo),冰上裂解 20 min。 4℃,10000 r/min 離心10 min。 用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。 將蛋白樣品按照等質(zhì)量上樣于10%的SDS-PAGE 電泳,冰水混合物中恒流濕轉(zhuǎn),5%封閉液(脫脂奶粉配置)室溫封閉 1 ～ 2 h。 一抗 leptin receptor(5%BSA,1 ∶1000,Abcam)、PI3K(1 ∶1000,CST)、 p-PI3K(1 ∶1000,CST)、AKT(1 ∶1000, CST)、p-AKT(1 ∶1000, CST)。4℃孵育過(guò)夜。 TBST 洗膜 3 次,每次 10 min。 兔抗山羊IgG 二抗(1 ∶10000,CST)搖床低速振蕩,室溫孵育1 h,TBST 洗膜3 次,每次10 min,化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光顯影。

1.3.5 細(xì)胞RNA 提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

收集LEPR+/+和LEPR-/-大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞,TRIzol 法(Thermo)提取 RNA,取1μg RNA 按照試劑盒方法(Takara)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA,RTPCR 檢測(cè) leptin receptor 以及 IL-6, i-NOS,IL1-β 等的表達(dá)。 以GAPDH 基因作為內(nèi)參,定量分析。 引物序列見(jiàn)表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,用Image J 軟件計(jì)算蛋白免疫印跡條帶灰度值和免疫熒光熒光值,采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行柱形圖繪制和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,多組數(shù)據(jù)采用方差分析F檢驗(yàn),并得到F值。

2 結(jié)果

2.1 LEPR 的表達(dá)、敲除效率及 LEPR-/-大鼠對(duì)LPS 刺激不耐受

為了確定LEPR 在腦中表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型,分離并培養(yǎng)大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元,用RT-PCR 分析LEPR 的表達(dá),結(jié)果表明,LEPR在小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中均有表達(dá)(圖1A)。 分離 LEPR 基因敲除大鼠 LEPR-/-的原代小膠質(zhì)細(xì)胞,Western blot 分析證實(shí),LEPR 蛋白表達(dá)被完全剔除(圖 1B)。 對(duì)比分析 LEPR+/+和LEPR-/-大鼠對(duì)LPS 刺激的反應(yīng)性,表明LEPR 敲除增加了大鼠LPS 刺激的敏感性,LEPR-/-大鼠在LPS刺激下48 h 內(nèi)生存率降低了75%。 (圖1C、1D)

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.2 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化情況

用小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志分子Iba1 的抗體,比較分析LEPR+/+和LEPR-/-大鼠大腦組化中小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài) (圖2A、2C),相比于LEPR+/+,LEPR-/-腦組織中處于靜息態(tài)(Resting)的小膠質(zhì)細(xì)胞減少了55.2%(n= 6,P＜0.001), 而趨于活化的肥大態(tài)(Hypertrophic)和阿米巴樣態(tài)(Amoeboid)的小膠質(zhì)細(xì)胞分別增加了34.7%和14.1%(n=6,P＜0.01)。LEPR-/-大鼠對(duì) LPS 刺激反應(yīng)更強(qiáng)烈,相對(duì)于LEPR+/+(LPS), LEPR-/-(LPS)大鼠腦組織中處于靜息態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞減少了 16.1%(n= 6,P＜0.01), 而趨于活化的肥大態(tài)和阿米巴樣態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞分別增加了 16.6%和 25.1%(n= 6,P＜0.01)。 (圖2B、2D)統(tǒng)計(jì)各種小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的數(shù)目作圖(圖2E)。

2.3 LEPR 敲除大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子分泌增加

為了進(jìn)一步明確LEPR-/-對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用,分別分離了來(lái)源于LEPR+/+和LEPR-/-大鼠的原代小膠質(zhì)細(xì)胞,用RT-PCR 對(duì)比分析了3 種炎性因子的mRNA 表達(dá)水平(圖3A ～3C)。 不存在刺激因素的情況下,與LEPR+/+相比LEPR 敲除導(dǎo)致IL-6, i-NOS,IL-1β 表達(dá)分別增多了 61.4 倍,53.7 倍和2.7 倍。 在LPS 刺激的情況下,LEPR 敲除導(dǎo)致 IL-6, i-NOS,IL-1β 表達(dá)分別增多了 3.3 倍,1.8 倍和1.9 倍,同時(shí)在A-C 三個(gè)多組數(shù)據(jù)中得到的F值分別是94.47,86.95 和33.64。 見(jiàn)圖 3D、3F,我們進(jìn)一步對(duì)LEPR+/+小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行瘦素蛋白處理,反向驗(yàn)證了LEPR 的激活可以抑制炎性因子表達(dá),證明敲除LEPR 會(huì)增強(qiáng)炎性因子表達(dá)。

圖1 LEPR 的表達(dá)、敲除效率及LEPR-/-大鼠對(duì)LPS 刺激不耐受Note. A, LEPR expression in microglia, astrocytes and neurons. B, The expression of LEPR gene in microglia of LEPR-/-was completely silenced. C/D, LEPR+/+ and LEPR-/-rat responses to LPS treatment and corresponding survival curves.Pairwise comparisons of the three groups of cells, *P＜0.05.Figure 1 Expression and knockout efficiency of LEPR and LEPR-/- rat tolerance to LPS treatment

圖2 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化情況Note. A/C, LEPR+/+ and LEPR-/- microglia morphology in rat brain slices. B/D,Morphology of microglia in brain slices,LEPR+/+(LPS) and LEPR-/-(LPS) rats. E, Microglia count.Compared with LEPR+/+rats and LEPR+/+(LPS) rats, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 2 Changes of microglia cell morphology and structure

圖3 LEPR 敲除大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子分泌增加Note. A～C,Expression of IL-6,i-NOS,IL-1β in the presence or absence of LPS stimulation. D-F,IL-6,i-NOS,IL-1β expression of in response to leptin.Compared with LEPR+/+rats and LEPR+/+(LPS) rats,*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 3 Increased secretion of inflammatory factors in microglia cells of LEPR knockout rats

2.4 LEPR 敲除大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)

小膠質(zhì)細(xì)胞的活化一般會(huì)伴隨著吞噬能力的增強(qiáng),分離LEPR+/+和LEPR-/-原代小膠質(zhì)細(xì)胞,對(duì)比分析其對(duì)Dextran 的吞噬(圖 4A、4B)和 Aβ 的吞噬(圖4C、4D),結(jié)果表明,相比于LEPR+/+小膠質(zhì)細(xì)胞,LEPR-/-小膠質(zhì)細(xì)胞Dextran 和Aβ 的吞噬分別增加了 10.3 倍和 6.5 倍(P＜0.05)。

2.5 PI3K/AKT 信號(hào)通路可能參與小膠質(zhì)細(xì)胞促炎促吞噬過(guò)程

分離 LEPR+/+和 LEPR-/-大鼠的腦組織,用Western blot 分析 JAK2、STAT3、PI3K、AKT、ERK1/2等信號(hào)分子的磷酸化(圖5A ～C)。 LEPR 敲除沒(méi)有明顯改變JAK2、STAT3和ERK1/ 2的磷酸化水平(結(jié)果未見(jiàn))。 LEPR 敲除反而激活了PI3K/AKT 通路LEPR-/-腦組織蛋白中PI3K 和AKT 的磷酸化分別增加了 2.9 倍和 1.6 倍(P＜0.05)。

圖4 LEPR 敲除大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)Note. A/B, Dextran phagocytosis. C/D, Aβ phagocytosis.Compared with LEPR+/+rats, *P＜0.05.Figure 4 Enhanced phagocytosis of microglia cells in rats with LEPR knockout

圖5 PI3K/AKT 信號(hào)通路可能參與小膠質(zhì)細(xì)胞促炎促吞噬過(guò)程N(yùn)ote. A, PI3K/AKT pathway. B, p-PI3K gray value. C, p-AKT gray value.Compared with LEPR+/+rats, *P＜0.05.Figure 5 PI3K/AKT signaling pathway may be involved in the proinflammatory and phagocytic process of microglia cells

3 討論

瘦素主要由脂肪組織分泌,與瘦素受體結(jié)合,除了調(diào)節(jié)能量代謝,還能作為炎性因子激活巨噬細(xì)胞,參與外周神經(jīng)性疼痛[18-20]。 表達(dá)在巨噬細(xì)胞中的瘦素受體維持著其吞噬,清除的能力,影響炎性因子的分泌,并被證實(shí)瘦素受體可單獨(dú)影響巨噬細(xì)胞不受其他因素干擾[21-22]。 小膠質(zhì)細(xì)胞認(rèn)為是腦組織中特化的巨噬細(xì)胞[14],但關(guān)于瘦素受體與小膠質(zhì)細(xì)胞的報(bào)道卻很少。 小膠質(zhì)細(xì)胞不管是本身的生物學(xué)特性,還是微環(huán)境與巨噬細(xì)胞有一定的差別,對(duì)巨噬細(xì)胞的研究結(jié)論不能簡(jiǎn)單的推理至小膠質(zhì)細(xì)胞。 本研究通過(guò) LEPR 敲除大鼠明確了在LEPR 缺失的情況下,小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)化為肥大形態(tài)和阿米巴樣形態(tài),并表現(xiàn)出促炎和促吞噬的表型。 推測(cè)Leptin/LEPR 在小膠質(zhì)細(xì)胞中,應(yīng)該是抗炎的,而不是巨噬細(xì)胞中的促炎作用。

LEPR 基因敲除導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化主要表現(xiàn)在三個(gè)方面:第一、LEPR-/-大鼠的腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞由靜息形態(tài)向肥大形態(tài)和阿米巴樣形態(tài)轉(zhuǎn)換,表現(xiàn)為胞體變大(圖2)。 小膠質(zhì)細(xì)胞的增生與肥大被認(rèn)為是M1 型的極化,通常與炎癥有關(guān)[23-25],阿米巴樣形態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞更傾向于吞噬[26-28]。 第二、LEPR-/-小膠質(zhì)細(xì)胞比LEPR+/+小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)更多的 IL-6,i-NOS 和 IL-1β 等炎性因子(圖 3)。 小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6 增多,通常認(rèn)為與腦損傷,自閉癥和多動(dòng)癥有關(guān)[29-30];IL-1β 和i-NOS 升高與神經(jīng)炎癥有關(guān)[31-32],在給予 LPS 刺激后,LEPR+/+組和LEPR-/-組的 IL-6,i-NOS 和 IL-1β 表達(dá)均升高,并且LEPR-/-組炎性因子升高更為明顯,我們發(fā)現(xiàn)LEPR敲除后發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了炎癥[10],提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能在LEPR-/-組在LPS 刺激后炎性因子明顯升高中發(fā)揮作用;此外我們也做了腫瘤壞死因子TNF-α 的表達(dá),發(fā)現(xiàn) LEPR-/-組 TNF-α 的表達(dá)存在爭(zhēng)議,這與我們預(yù)期不符(結(jié)果未顯示),猜測(cè)LEPR的敲除會(huì)降低磷酸酶D1 的表達(dá)從而抑制了TNF-α的表達(dá);第三、LEPR-/-小膠質(zhì)細(xì)胞比LEPR+/+小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的吞噬Aβ 和Dextran 的能力(圖4),這與小膠質(zhì)細(xì)胞由靜息形態(tài)向阿米巴樣形態(tài)轉(zhuǎn)變結(jié)果相符合。 無(wú)論是在 leptin 突變的 ob/ob 和LEPR 突變的db/db 小鼠,都有明顯的腦損傷和神經(jīng)炎癥[12-13], 結(jié)合我們的研究結(jié)果,ob/ob 和db/db小鼠的神經(jīng)炎癥不僅僅是肥胖和2 型糖尿病引起的,一部分原因應(yīng)該是leptin 和LEPR 的功能缺失引起的小膠質(zhì)細(xì)胞活化。 我們對(duì)比分析了幾種可能參與小膠質(zhì)細(xì)胞活化的信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)LEPR 敲除沒(méi)有明顯改變JAK2、STAT3 和ERK1/2 的磷酸化水平,反而是激活了PI3K/AKT 通路(圖5),有報(bào)道認(rèn)為,PI3K/AKT 激活,能調(diào)節(jié) IL-6,i-NOS,IL-1β,TNF-α 等炎性因子的表達(dá)[33-34],我們的結(jié)果未能解釋LEPR 敲除如何激活了PI3K/AKT 通路,但是該通路的激活可能是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的信號(hào)通路之一。

綜上所述,本研究在瘦素受體敲除的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞向著促炎促吞噬的表型轉(zhuǎn)變,首次將瘦素受體與小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)炎癥聯(lián)系起來(lái),并揭示了LEPR/Leptin 可能通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥,并可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)里面發(fā)揮著某種保護(hù)性作用。