趙月鳴，韓秀娟，邢德君

(吉林省腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科，吉林 長春 130012)

每年全球有超過945 000的人們發(fā)展成為結(jié)直腸癌，其中大約492 000人死亡[1]。原發(fā)性結(jié)直腸癌多由遺傳性腫瘤綜合征或炎癥性腸病發(fā)展而來[2]。因此，結(jié)直腸癌的篩查和預(yù)防工程的普及就顯得尤為重要。當(dāng)前已知在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中一些腫瘤相關(guān)的蛋白表達發(fā)生了明顯的改變，而且其致病的分子機制也已經(jīng)被廣泛鑒別并加以闡明[3]。關(guān)于結(jié)直腸癌發(fā)病的分子機制方面的新進展終將對其靶向治療起到指導(dǎo)作用，因此進一步探討與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因?qū)W研究至關(guān)重要。TPM4是肌動蛋白結(jié)合蛋白中原肌球蛋白家族的一員，其表達水平的異常已經(jīng)在幾種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，TPM4被認(rèn)為是卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、角化棘皮瘤與食管鱗狀細(xì)胞癌的潛在的檢測標(biāo)志物[4]。本研究探討TPM4在結(jié)直腸癌中的表達及其生物學(xué)意義。

1 資料與方法

1.1研究對象:選擇2018年10月～2019年10月吉林省腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織，癌旁正常組織取材需位于癌組織上端，且距離腫瘤邊緣≥5 cm，經(jīng)術(shù)后病理證實為陰性。結(jié)直腸癌標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理確診為腺癌，術(shù)前均未接受任何治療。30例結(jié)直腸癌患者男19例，女11例，年齡36～73歲，結(jié)腸癌22例，直腸癌8例，TNM分期Ⅰ期 3例，ⅡA 2例，ⅡB 5例，ⅡC 4例，ⅢA 2例，ⅢB 5例，ⅢC 4例，ⅣA 5例，分化程度低分化9例，中分化18例，高分化3例。腫瘤大小≥5 cm者8例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，有遠處轉(zhuǎn)移者5例。

1.2蠟塊標(biāo)本的制作過程:① 取材和固定:標(biāo)本離體后先用生理鹽水沖洗，立即放入固定液(10%甲醛)中，使其蛋白質(zhì)等成分迅速凝固，以保持組織原來的結(jié)構(gòu)。②脫水:依次經(jīng)70%、80%、90%、95%以及無水乙醇脫水，以去凈組織塊內(nèi)的水分，最后完全由純酒精取代。③透明:將組織標(biāo)本取出，放入二甲苯中，使酒精被二甲苯所置換。④浸蠟:將透明好的組織塊放入已熔化的石蠟內(nèi)，使石蠟浸入組織，從而替換出二甲苯。⑤包埋:向包埋器內(nèi)倒入熔化的石蠟，將浸蠟后的組織塊放入，待蠟液表面凝固后將其投入冷水中，使石蠟自然凝固。修整蠟塊，備用。

1.3免疫組化測定結(jié)直腸癌組織中TPM4表達:①蠟塊4 μm連續(xù)切片，貼于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的載玻片上，60℃烘烤24 h備用。②切片經(jīng)二甲苯脫蠟5 min×3，梯度酒精(100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、85%各5 min)至水。③蒸餾水新鮮配制3%雙氧水，室溫孵育5～10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3 min，共洗3次：④微波修復(fù)抗原:將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖溶液(pH值6.0)，放入微波爐在中高火條件下加熱5 min，然后冷卻10 min，再次在中高火條件下加熱3 min，最后自然冷卻至室溫。⑤0.01MPBS洗5 min，共洗3次。⑥滴加5%正常山羊血清封閉，置于保濕盒中 37℃，30 min,用濾紙將多余的液體吸干，不洗。⑦ 滴加TPM4一抗，4℃濕盒過夜，陰性對照滴加PBS液體，0.01MPBS洗5 min，共洗3次。⑧滴加TPM4 二抗，在37℃條件下放置30 min，用0.1MPBS洗3 min，共洗3次。⑨辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，置于保濕盒中 37℃，30 min，0.01MPBS洗3 min，共洗3次。⑩滴加新鮮配制DAB顯色劑，鏡下觀察，控制染色時間約5 min，且應(yīng)用自來水充分沖洗切片至少10 min，終止顯色反應(yīng)。蘇木素復(fù)染 1～5 min，蒸餾水充分洗滌，置于1%的鹽酸酒精中分化約20 s，蒸餾水充分洗滌去分化，放入1%的氨水中返藍約30 s，蒸餾水充分洗滌后乙醇逐級脫水(70%、80%、90%、100%Ⅰ、100%Ⅱ各2 min)，二甲苯透明(二甲苯5 min×3)，再用中性樹膠滴于切片上封片。

1.4免疫組化結(jié)果半定量判斷標(biāo)準(zhǔn)：①TPM4陽性表達主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，在顯微鏡下可見TPM4陽性反應(yīng)物表現(xiàn)為棕黃色或者棕褐色顆粒；胞漿內(nèi)未出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒的細(xì)胞則為TPM4表達陰性細(xì)胞。②評分標(biāo)準(zhǔn)：我們請兩位病理科專家在普通光學(xué)顯微鏡(200×視野)下進行雙盲閱片，每例隨機挑選5個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。根據(jù)切片中陽性細(xì)胞所占比例和陽性細(xì)胞染色強弱判斷結(jié)果。① 陽性細(xì)胞所占比例計分：0分：陽性細(xì)胞比例<5%；1分：陽性細(xì)胞比例6%～25%；2分：陽性細(xì)胞比例26%～50%；3分：陽性細(xì)胞比例51%～75%；4分：陽性細(xì)胞比例>75%。② 陽性細(xì)胞顯色強度計分：0分：基本未著色；1分：細(xì)胞染色為淡棕黃色；2分：細(xì)胞染色為棕色；3分：細(xì)胞染色為深棕色。③ 將①和②兩項分值相乘，所得數(shù)值作為判斷標(biāo)本陽性等級的標(biāo)準(zhǔn)。陰性(-)：0分，弱陽性(+)：1～4分，陽性(++)：5～8分，強陽性(+++)：9～12分。陽性表達率(%)=(弱陽+陽性+強陽)/總例數(shù)×100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析；樣本率比較采用四格表資料的確切概率法分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TPM4在人結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達：TPM4蛋白陽性反應(yīng)物主要分布于結(jié)直腸癌及癌旁組織細(xì)胞胞質(zhì),但在癌組織中的表達明顯強于癌旁組織，見圖1。在結(jié)直腸癌組織中，TPM4陽性表達率為63.3%(19/30)；在癌旁組織中，TPM4的陽性表達率為23.3%(7/30)。結(jié)直腸癌組織與癌旁組織比較，TPM4的陽性表達率具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表1。

圖1 TPM4在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達及分布(DAB,×200)

表1 結(jié)直腸癌及癌旁組織中TPM4表達水平(例)

2.2結(jié)直腸癌組織TPM4陽性率與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系：結(jié)直腸癌腫瘤TPM4蛋白表達的水平與腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)，而與TNM分期、腫瘤大小、腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、性別、年齡無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 結(jié)直腸癌病人組織TPM4水平與臨床參數(shù)的關(guān)系(例)

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生機制尚未完全明確，早期診斷存在困難。目前，只要無手術(shù)禁忌證，治療結(jié)直腸癌首選治療方案為手術(shù)治療，根治術(shù)后病理結(jié)果決定術(shù)后是否行化療及放療[5]。術(shù)后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的重要原因[6]。如果能盡早發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶并及時給予相應(yīng)治療，對延長生存期、提高生活質(zhì)量的具有重要意義[7]。

TPM是以大量異構(gòu)體形式廣泛分布于各種真核細(xì)胞中。它是細(xì)肌絲中與肌動蛋白的結(jié)合蛋白，是肌肉收縮過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，在肌肉細(xì)胞調(diào)節(jié)收縮過程中鈣離子的敏感性[8]。在非肌肉細(xì)胞，原肌球蛋白不僅在收縮過程中起作用，而且在穩(wěn)定細(xì)胞骨架肌動蛋白絲動力學(xué)、細(xì)胞分裂、胞質(zhì)分裂和細(xì)胞內(nèi)囊泡運輸?shù)确矫嫫鸬椒浅Ｖ匾淖饔肹9]。研究表明，在一些腫瘤中TPM在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和腫瘤生長調(diào)控中起著非常重要的作用[10]。Qi等人研究發(fā)現(xiàn)TPM4蛋白表達與食管鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤分化程度相關(guān)[11]。Suehara等發(fā)現(xiàn)根據(jù)軟組織肉瘤組織學(xué)分類和分級的不同，幾個TPM的亞型表達也有差異[12]。研究發(fā)現(xiàn)TPM4在乳腺癌組織中呈高表達，但TPM4表達與腫瘤大小、年齡及腫瘤分期無相關(guān)性，但與乳腺腺組織SBR分級有關(guān)，也就是說SBR分級級別越高，惡性度越高，TPM4表達越強[13]。Kabbage等人經(jīng)研究報道乳腺癌組織中TPM4陽性表達率達77.1%，但TPM4蛋白表達僅于乳腺癌分級有關(guān)，與腫瘤大小、年齡及腫瘤分期無相關(guān)性[14]。本試驗經(jīng)免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)TPM4陽性表達率僅66.3%，但低于Kabbage等中所提及TPM4蛋白陽性表達率[14]，考慮一方面是本實驗病人樣本量較小，另一方面考慮為結(jié)直腸癌組織中TPM4陽性表達率低，TPM4在癌組織中的表達可能有差異。

根據(jù)目前的調(diào)查，我們認(rèn)為TPM4可能在結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生過程起到非常重要的作用。但TPM4如何促進結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制仍不清楚。到現(xiàn)在為止，只有少數(shù)的研究試圖將TPM表達的變化與致癌信號傳導(dǎo)途徑聯(lián)系起來。作為一個例子，Zheng等人研究表明特定TPM的亞型在TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞運動控制方面起重要作用，在細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力方面也起到很重要的作用[15]。人乳腺上皮細(xì)胞中，表皮生長因子受體和TPM獲得性細(xì)胞骨架元素之間也建立聯(lián)系[16]。特殊的HMW TPM亞型在乳腺癌中引到腫瘤抑制劑的作用。Prasad等透露，在這種情況下，通過RNAi技術(shù)使HMW TPM1表達減少，對于增強細(xì)胞運動和增強腫瘤侵襲能力起到至關(guān)重要的作用[17]。有趣的是，一些研究揭露，當(dāng)HMW TPM1消失時，癌細(xì)胞越來越依賴于LMW TPM4的表達[18-21]。在當(dāng)今的研究中TPM4高效表達與其他文獻所表達的HMW TPMs下調(diào)有關(guān)[22]。

總之，本研究證實了TPM4在腫瘤組織中過表達。我們還發(fā)現(xiàn)TPM4表達與腫瘤的分期與分化程度相關(guān)，提示TPM4可能為結(jié)直腸癌的診斷和指導(dǎo)治療以及判斷預(yù)后提供了一個新的靶點。