雷家秀，朱雅萍，張 雨

(鄭州市第七人民醫(yī)院 麻醉科，河南 鄭州 450000)

膿毒癥(sepsis)是一種由感染引起的全身性炎性反應(yīng)綜合征，可導(dǎo)致多器官功能障礙，尤其是心血管系統(tǒng)。常常導(dǎo)致心肌受損、收縮力減弱和心舒張功能障礙，嚴(yán)重影響心臟功能。目前尚無有效的治療方法。依托咪酯(etomidate，Eto)是咪唑類衍生物，由于其起效快、安全性高、對(duì)心血管和呼吸系統(tǒng)影響輕微等優(yōu)點(diǎn)，是臨床常用的麻醉誘導(dǎo)劑之一。Eto具有降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平及炎性反應(yīng)，對(duì)膿毒癥機(jī)體具有保護(hù)作用[1-3]。miR-290-5p是miR-290-295簇的成員之一，異丙酚通過上調(diào)膿毒癥大鼠miR-290-5p的表達(dá)減輕膿毒癥引起的急性腎損傷[4]。但Eto能否通過調(diào)控miR-290-5p表達(dá)，減輕膿毒癥心肌損傷尚未可知。本研究初步探討Eto對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響及分子機(jī)制，為防治膿毒癥心肌損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠心肌細(xì)胞系(rat myocardial cell line H9C2,H9C2)(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素溶液(Hyclone公司)；脂多糖(Sigma-Aldrich公司)；依托咪酯(純度≥99.8%)(中國食品藥品檢定研究院)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞活力檢測試劑盒、膜聯(lián)蛋白異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Trizol試劑和RIPA裂解液(北京索萊寶生物科技公司)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量ELISA檢測試劑盒(R&D Systems公司)；miR-290-5p模擬物(miR-290-5p mimics)、miR-290-5p抑制物(anti-miR-290-5p)、模擬物陰性對(duì)照(miR-con)、抑制物對(duì)照(anti-miR-con)以及PCR引物(北京華大基因公司)；兔抗cleaved-caspase-3抗體、兔抗cyclinD1抗體以及山羊抗兔IgG(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理:用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2細(xì)胞。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞分為對(duì)照(control)組；LPS組(終濃度為1 mg/L的LPS處理H9C2細(xì)胞[5])；2 mg/L Eto+LPS組(終濃度為2 mg/L的Eto預(yù)處理H9C2后進(jìn)行LPS誘導(dǎo))；4 mg/L Eto+LPS組(終濃度為4 mg/L的依托咪酯預(yù)處理H9C2后進(jìn)行LPS誘導(dǎo))；miR-con+LPS組(轉(zhuǎn)染miR-con后進(jìn)行LPS處理)；miR-290-5p+LPS組(轉(zhuǎn)染miR-290-5p mimics后進(jìn)行LPS處理)；Eto+anti-miR-con+LPS組(轉(zhuǎn)染miR-con后用終濃度為4 mg/L的依托咪酯和1 mg/L的LPS處理)；Eto+anti-miR-290-5p+LPS組(轉(zhuǎn)染miR-290-5p mimics后用終濃度為4 mg/L的依托咪酯和1 mg/L的LPS處理)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力;各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，按照5×103個(gè)/孔接種到96孔板，24 h后每孔加入20 μL的MTT，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，加入150 μL的DMSO振蕩溶解10 min，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度值。

1.2.3 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;收集各組H9C2細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，采用1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取100 μL細(xì)胞懸液加入流式管，分別加入5 μL的annexin V-FITC和PI，避光孵育15 min，補(bǔ)加1×結(jié)合緩沖液至500 μL，立即上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6含量:按照ELISA試劑盒說明書在反應(yīng)孔內(nèi)加入100 μL待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照孔內(nèi)加入100 μL的稀釋液，酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的含量。

1.2.5 Western blot檢測cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá):采用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE。當(dāng)?shù)鞍追蛛x后，采用常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將膜置于5%的脫脂牛奶中封閉1 h，PBST洗膜3 min。將膜置于稀釋的Ⅰ抗溶液中室溫孵育2 h，PBST洗膜10 min，洗3次；再將膜置于稀釋的Ⅱ抗溶液中室溫孵育1 h，PBST洗膜10 min，洗3次?；瘜W(xué)發(fā)光顯色劑顯色后，利用ImageJ進(jìn)行分析，以目的蛋白的吸光度值與內(nèi)參蛋白吸光度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

1.2.6 RT-qPCR檢測miR-290-5p的表達(dá)水平:收集各組H9C2細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下：miR-290-5p上游引物5′-GCTGGGTTTC ACGGGGGTATCAA-3′，下游引物5′-TCAACTGAGTG CCGTAGGGTGCG-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGG CAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACG AATTTGCGTGTC-3′。以U6為內(nèi)源性參照，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Eto對(duì)LPS處理的心肌細(xì)胞H9C2存活率的影響

與對(duì)照組比較，LPS組H9C2細(xì)胞存活率顯著降低；與LPS組比較，Eto+LPS組H9C2細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)(表1)。

表1 不同濃度Eto對(duì)LPS處理的H9C2活性的影響

2.2 不同濃度Eto對(duì)LPS處理的心肌細(xì)胞H9C2凋亡和炎性因子表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，LPS組H9C2細(xì)胞cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞培養(yǎng)液TNF-α和IL-6的含量顯著升高；與LPS組比較，Eto+LPS組H9C2細(xì)胞cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞培養(yǎng)液TNF-α和IL-6的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。選取保護(hù)作用較強(qiáng)的Eto濃度(4 mg/L)進(jìn)行后續(xù)研究(圖1，表2)。

表2 不同濃度Eto對(duì)LPS處理的H9C2凋亡和炎性因子表達(dá)水平的影響

2.3 依托咪酯對(duì)miR-290-5p表達(dá)的影響

與NC組比較，LPS組H9C2細(xì)胞miR-290-5p的表達(dá)顯著降低；與LPS組比較，LPS+Eto組H9C2細(xì)胞miR-290-5p的表達(dá)顯著升高(P<0.05)(表3)。

表3 依托咪酯對(duì)miR-290-5p表達(dá)的影響

2.4 高表達(dá)miR-290-5p對(duì)LPS處理的心肌細(xì)胞H9C2增殖、凋亡和炎性因子釋放的影響

與NC組比較，LPS組H9C2細(xì)胞miR-290-5p和cyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著降低，cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的含量顯著升高；與miR-con+LPS組比較，miR-290-5p+LPS組H9C2細(xì)胞miR-290-5p和cyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著升高，cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率顯著降低，細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的含量顯著降低(P<0.05)(圖2，表4)。

A.flow cytometry detected apoptosis; B.Western blot detected cleaved-caspase-3 protein expression圖1 不同濃度Eto對(duì)LPS處理的H9C2凋亡和炎性因子表達(dá)水平的影響

圖2 Western blot檢測cyclinD1和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)Fig 2 Western blot detected the expression of cyclinD1 and cleaved-caspase-3 proteins

表4 高表達(dá)miR-290-5p對(duì)LPS處理的心肌細(xì)胞H9C2增殖、凋亡和炎性因子釋放的影響

2.5 低表達(dá)miR-290-5p可以降低Eto對(duì)LPS處理的心肌細(xì)胞H9C2增殖、凋亡和炎性因子釋放的影響

與Eto+anti-miR-con+LPS組比較，Eto+anti-miR-290-5p+LPS組H9C2細(xì)胞miR-290-5p和cyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的含量顯著升高(P<0.05)(圖3，表5)。

表5 低表達(dá)miR-290-5p可以降低Eto對(duì)LPS處理的H9C2增殖、凋亡和炎性因子釋放的影響

圖3 Western blot檢測cyclinD1和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)Fig 3 Western blot detected the expression of cyclin D1 and cleaved-caspase-3 proteins

3 討論

心肌損傷及由此導(dǎo)致的心臟功能障礙是膿毒癥最常見的并發(fā)癥。LPS又叫內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌外膜的主要組成部分，可通過進(jìn)入淋巴和循環(huán)系統(tǒng)引起全身炎性反應(yīng)、內(nèi)毒素血癥、感染性休克和多器官衰竭，其誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷是最常用的膿毒癥心肌損傷模型[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS顯著降低H9C2細(xì)胞存活率，顯著增加細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α和IL-6的表達(dá)，與既往研究[7]結(jié)果基本吻合。表明心肌損傷細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

Eto是一種咪唑類靜脈麻醉藥，其對(duì)心肌細(xì)胞的存活狀態(tài)、舒張時(shí)間以及收縮幅度影響輕微，因此很快在臨床被普及[8]。Eto預(yù)處理還可減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[9]、進(jìn)行體外循環(huán)手術(shù)時(shí)，應(yīng)用Eto進(jìn)行靜脈麻醉可減輕機(jī)體的炎性反應(yīng)[10]，Eto對(duì)LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β的分泌也有明顯抑制作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度Eto可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的促炎因子TNF-α及IL-6的分泌、減輕心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)和LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，提示Eto對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類18～22個(gè)核苷酸的短鏈非編碼RNA，其通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合發(fā)揮翻譯調(diào)節(jié)因子作用，涉及多種種疾病，包括LPS誘導(dǎo)的心肌損傷[12]。LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-146a表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-146a提高心肌細(xì)胞抗氧化活性，抑制炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[13]。在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥心肌組織中miR-21-3p表達(dá)上調(diào)，抑制miR-21-3p表達(dá)可改善LPS導(dǎo)致的心功能下降、自噬增高、線粒體超微損傷和心肌肥大，提高小鼠生存率[14]；抑制miR-203也可減少LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷后，miR-290-5p的表達(dá)顯著下調(diào)，而Eto可顯著增加miR-290-5p的表達(dá)水平。高表達(dá)miR-290-5p后心肌細(xì)胞存活率顯著升高，TNF-α和IL-6的分泌以及細(xì)胞凋亡率顯著降低，減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)miR-290-5p可逆轉(zhuǎn)Eto對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。提示Eto通過調(diào)控miR-290-5p表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，異丙酚通過調(diào)控miR-290-5p表達(dá)減輕LPS誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷支持了本研究觀點(diǎn)[4]。

綜上所述，依托咪酯通過提高細(xì)胞活力、減少細(xì)胞凋亡和抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，保護(hù)H9C2細(xì)胞免受脂多糖誘導(dǎo)的炎性損傷，其機(jī)制與上調(diào)miR-290-5p表達(dá)有關(guān)。本結(jié)果為依托咪酯在防治膿毒癥心肌損傷中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。