劉高澳，彭小忠,2*，舒鵬程*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室 醫(yī)學(xué)靈長類研究中心 神經(jīng)科學(xué)中心，北京 100005；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所，云南 昆明 650118)

神經(jīng)發(fā)生是哺乳動物大腦神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生功能性神經(jīng)元的過程[1]，由多種信號通路、生長因子、編碼和非編碼RNA控制的。大腦皮層和海馬是形成學(xué)習(xí)與記憶等功能的關(guān)鍵腦區(qū)，其發(fā)育異常會導(dǎo)致智力障礙。DICER屬于RNaseIII[2]，敲除Dicer1基因后不能產(chǎn)生成熟microRNAs(miRNAs)[3]，在神經(jīng)系統(tǒng)中Dicer1缺失會令小鼠出生后早期死亡[4]。miRNAs在神經(jīng)干細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)增殖、遷移、分化[5]以及調(diào)控凋亡和存活相關(guān)信號通路的作用[6]。因此，Dicer1敲除小鼠是研究miRNAs作用的必要工具鼠。D6是小鼠mDach1基因的增強子，其Cre重組酶活性主要表達(dá)在新皮層和海馬區(qū)域[7]，E10.5起始表達(dá)，E12.5時在背側(cè)皮層廣泛表達(dá)[8]。

本研究利用D6-Cre在發(fā)育早期條件性敲除Dicer1，結(jié)合RNA-seq技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄水平上具體分析在神經(jīng)干細(xì)胞中敲除Dicer1后的基因表達(dá)差異，研究miRNAs對大腦皮層早期發(fā)育的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與動物：SPF級Dicer1-floxed小鼠(南京大學(xué)模式動物研究所)(JAC LAB NUMBER:006001)；SPF級D6-Cre工具鼠(美國耶魯大學(xué)鐘偉民教授惠贈)。Dicer1-floxed純合型小鼠與D6-Cre進(jìn)行交配進(jìn)而獲得D6-Cre介導(dǎo)的Dicer1條件性敲除小鼠。

1.1.2 主要試劑：多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)、溴化乙啶(ethidium bromide, EB)、焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidine-2-phenyl indole, DAPI)(Sigma公司)；蔗糖、蛋白酶K(Proteinase K)、Trizol(Invitrogen公司)；Anti-NeuroD2 antibody(Abcam公司)；瓊脂糖(Gibco公司)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining, HE)、辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔 IgG(中杉金橋生物公司)；二甲苯、無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；50 bp DNA Ladder(天根生化科技有限公司)；引物合成(北京擎科生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型:剪取對應(yīng)標(biāo)號的腳趾組織，加入裂解液并提取DNA組，測定濃度后，進(jìn)行上樣、電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠置于Bio-Rad成像儀中曝光，并分析條帶。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primers

1.2.2 樣品的獲取、處理與測序：孕鼠脫頸法處死，采集E14.5小鼠大腦背側(cè)皮層組織，液氮速凍，并置-80 ℃冰箱保存待測。使用Trizol法從小鼠腦組織中提取總RNA。NanoPhotometer spectrophotometer檢測RNA純度(A260/A280在1.8～2.1，A230不低于1.7)并純化mRNA，將所得到的mRNA隨機打斷成片段，再用隨機引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA片段，再對cDNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，并連接測序接頭，富集純化的cDNA模板后用Agilent 2100 bioanalyzer自動化電泳分析，對文庫進(jìn)行質(zhì)檢，最后上機測序。制備的RNA樣品委托諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行分析。使用DESeq2軟件(1.16.1)進(jìn)行兩個比較組合之間的差異表達(dá)分析。通過 clusterProfiler R軟件實現(xiàn)差異表達(dá)基因的GO富集分析。

1.2.3 蘇木精-伊紅染色檢查 D6-Cre-Dicer1條件性敲除小鼠表型：用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定腦組織標(biāo)本，OCT包埋，切片，經(jīng)HE染色后，在顯微鏡下觀察腦組織整體形態(tài)變化。

1.2.4 免疫熒光檢測D6-Cre-Dicer1條件性敲除小鼠表型：切片從-80 ℃冰箱取出，在室溫放置10～15 min使之恢復(fù)至室溫。同時，打開烘箱，調(diào)至50 ℃預(yù)熱，烘烤15 min；浸入1×PBS中5 min，兩次。以0.3% Triton-X100-PBS配制5%綿羊血清封閉液，封閉組織45 min。將一抗按照說明書比例稀釋至0.3% Triton-X100-PBS中，一抗孵育組織4 ℃過夜。第2天，放置1×PBS中5 min，兩次洗片后，加入二抗稀釋液，置于濕盒內(nèi)，放在室溫下避光2～3 h。避光洗片后，在其上滴加含DAPI的熒光封片劑進(jìn)行封片。使用激光共聚焦顯微鏡(Olympus，F(xiàn)V-1000)進(jìn)行免疫熒光結(jié)果拍照，使用Photoshop CS6對圖像進(jìn)行裁剪，使用Adobe illustrator CS6進(jìn)行圖像編排與繪圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Dicer1條件敲除小鼠的獲得和表型分析

Dicer1-floxed小鼠根據(jù)敲除策略(圖1A)以PCR鑒定小鼠基因型，Dicer1突變純合型條帶大小為420 bp，Cre條帶大小為481 bp，D6-Cre-Dicer1小鼠構(gòu)建成功(圖1B)。

初步觀察，Dicer1條件性敲除小鼠出生1個月左右，較野生型相比，體型瘦弱，行動遲緩運動無力。爬行緩慢，且對應(yīng)激不敏感。分離出生后28 d的Dicer1條件敲除小鼠大腦組織，與野生型相比，敲除組大腦組織體積明顯變小(圖1C)，質(zhì)地較軟，結(jié)構(gòu)不清，邊緣模糊。出生后3 d小鼠腦組織切片HE染色，與對照組比，敲除組大腦皮質(zhì)明顯變薄，海馬變小且結(jié)構(gòu)部分缺失。免疫熒光(immunofluorescence，IF)染色檢測神經(jīng)元情況(NeuroD2，神經(jīng)元標(biāo)志物)，敲除組小鼠大腦皮質(zhì)中NeuroD2+細(xì)胞減少且分布異常(圖1D)。因此，D6-Cre介導(dǎo)的Dicer1條件性敲除，導(dǎo)致皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育異常。

A.knockout strategy for Dicer1; B.genotype was identified by PCR; C.ablation of Dicer1 by D6-Cre seriously affects telencephalon structure(n≥3); D.HE staining to detect the tissue structure and morphology, hippocampus was smaller than controls; IF staining was used to detect neuronal dysplasia, neurons were greatly reduced(n≥3)

2.2 D6-Cre介導(dǎo)的Dicer1 cKO對神經(jīng)干細(xì)胞干性的影響

提取E14.5小鼠背側(cè)端腦組織總 RNA，利用RNA-seq對Dicer1敲除前后進(jìn)行差異基因篩選(P<0.05)。與對照組相比，條件敲除組中Dicer1明顯下調(diào)(P<0.01)。篩選得到差異表達(dá)基因45個，上調(diào)基因11個，下調(diào)基因34個(圖2A)。

檢測干細(xì)胞相關(guān)表型基因(Sox9、Id3、Aldoc、Clu、Sox2、Prom1、Ntm、Gja1、Atp1a2、Cenpf、Cdk1、Apoe、Pax6)，實驗組神經(jīng)干細(xì)胞中高表達(dá)的Sox2、Pax6等基因無明顯表達(dá)差異，其他在干細(xì)胞中高表達(dá)的基因在Dicer1敲除前后也無明顯改變(圖2B)。大腦皮層特異層次表達(dá)的標(biāo)志物中，Cux1、Cux2、Brn2、Satb2在Dicer1敲除前后表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，Er81、Rorb、Tle4、Sox5在Dicer1敲除前后表達(dá)量無明顯改變(圖2C)。E14.5腦組織免疫熒光染色，Pax6+的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量在神經(jīng)元發(fā)生時期尚未見明顯改變(n≥3)(圖2D)，Dicer1 cKO小鼠中神經(jīng)元的減少并不是由于神經(jīng)前體細(xì)胞的減少引起的。

2.3 D6-Cre-Dicer1 cKO主要影響的信號通路

GO功能富集分析，圖3顯示了部分差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞成分富集結(jié)果。Dicer1條件性敲除前后主要受影響的信號通路為NF-κB信號通路、Wnt信號通路、MAPK-ERK信號通路和JAK-STAT信號通路等。Dicer1敲除后，可誘發(fā)DNA損傷和相關(guān)通路的應(yīng)激。

圖3 差異表達(dá)基因GO 分析圖Fig 3 GO term of the differentially expressed genes

2.4 Dicer1 cKO 對神經(jīng)干細(xì)胞中l(wèi)ncRNA Xist表達(dá)的影響

RNA-seq測序差異表達(dá)倍數(shù)前10的下調(diào)基因如表2，Xist的表達(dá)在Dicer1敲除后大量減少(P<0.001)。Xist是雌性X染色體失活必須的，經(jīng)檢測Dicer1敲除后位于X染色體上的Acsl4、Clcn5、Brwd5、Chic1、Vma21、Magt1、Phf6、Zfp275基因表達(dá)量上調(diào)(P<0.05)(圖4A)。Dmrta2、Dmrt3、Sox3、Sox9、Sox17、Sox21、Sox30等個體性別發(fā)育相關(guān)基因，在Dicer1敲除前后表達(dá)量無明顯差異(圖4B)。Dicer1敲除不影響常染色體Suz12和Ezh2編碼產(chǎn)物表達(dá)量(圖4C)。

表2 Dicer1條件性敲除后差異表達(dá)前10的基因

3 討論

70%的miRNAs在哺乳動物的大腦中表達(dá)[9]，而且許多miRNAs的表達(dá)水平在大腦發(fā)育過程中都發(fā)生了變化[10]，本實驗通過HE染色和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，D6-Cre介導(dǎo)的Dicer1的特異性敲除會導(dǎo)致出生后的小鼠大腦皮層發(fā)育異常，提示miRNAs可能在此過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合系統(tǒng)生物信息學(xué)在全基因組水平分析Dicer1條件性敲除前后的基因表達(dá)差異。Dicer1特異性敲除前后，干性相關(guān)基因表達(dá)量無明顯差異，特定皮層標(biāo)志物Cux1、Cux2、Brn2、Satb2表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05)。與此前報道的，miRNAs對干細(xì)胞自我更新是非必須的，對新皮層中指定皮層的命運決定是必不可少的[11]結(jié)果相一致。

A.the differences in genes between the control group and Dicer1 cKO group were mapped to the volcano chart(P<0.05); B.statistical comparison the expression of neural stem cell markers; C.statistical comparison the marker expressed in specific layers of cerebral cortex; D.IF staining detected the expression differences of Pax6 in cerebral cortex of E14.5 mice(n≥3)

信號通路可被miRNAs靶向調(diào)節(jié)，實現(xiàn)通路之間的cross-talk。Dicer1敲除后主要受影響的信號通路為NF-κB信號通路、Wnt信號通路、MAPK-ERK信號通路和JAK-STAT信號通路。且神經(jīng)發(fā)生早期Dicer1敲除，引發(fā)DNA損傷相關(guān)通路的應(yīng)激。lncRNA Xist在雌性哺乳類X染色質(zhì)沉默中發(fā)揮作用，是X染色體去活化的主要影響因子[12]。lncRNA Xist被DICER加工后可發(fā)揮生物學(xué)作用[13]，Dicer1缺失的情況下，lncRNA Xist穩(wěn)定性受影響[14]。轉(zhuǎn)錄組分析得到Dicer1敲除lncRNA Xist表達(dá)大量減少后，X染色體上Acsl4、Clcn5、Brwd5、Chic1等基因表達(dá)上調(diào)，X染色質(zhì)沉默輔助多梳蛋白Suz12和Ezh2表達(dá)量無明顯差異，結(jié)果與在胚胎干細(xì)胞(ES)中的檢測結(jié)果一致[14]。此外，性別決定相關(guān)基因無明顯表達(dá)差異，Dicer1對lncRNA Xist的調(diào)節(jié)作用與性別無關(guān)。在神經(jīng)發(fā)生早期lncRNA Xist對神經(jīng)干細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用還需進(jìn)一步探索。

A.genes expression on X chromosome were increased after Dicer1 cKO(P<0.05); B.influenced on sex-determined genes expression in Dicer1 cKO; C.red arrows showed increased significantly compared with Ctrl group(P<0.05); blue arrow showed decreased significantly compared with Ctrl group(P<0.05); black arrows showed no significantly difference compared with Ctrl group

綜上所述，本研究利用Dicer1條件敲除鼠研究miRNAs對大腦皮層早期發(fā)育的調(diào)控作用。結(jié)果表明，miRNAs對于干細(xì)胞干性維持非必須，但參與指定皮層的命運決定過程。Dicer1的缺失將導(dǎo)致lncRNA Xist表達(dá)水平的下調(diào)，且其中的調(diào)控機制與性別無關(guān)。