王 弦，江冬瑞，李曉燦，黃成晨，吳 強(qiáng)

HER-2基因?qū)儆谠┗颍琀ER-2陽(yáng)性乳腺癌惡性程度較高且易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。目前國(guó)內(nèi)外已有針對(duì)HER-2基因過表達(dá)的靶向藥物(赫賽汀)，可大大降低乳腺癌患者的惡性風(fēng)險(xiǎn)。因此，確定乳腺癌HER-2的狀態(tài)非常重要。針對(duì)HER-2的檢測(cè)方法主要有免疫組化法和原位雜交法，原位雜交法中熒光原位雜交法效果最佳，其是直接針對(duì)HER-2基因擴(kuò)增檢測(cè)，并設(shè)置了17號(hào)染色體著絲粒作為內(nèi)對(duì)照[1-2]，但該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、操作人員要求均較高，檢測(cè)費(fèi)用是免疫組化法的10～15倍。因此，乳腺癌患者應(yīng)先行HER-2免疫組化檢測(cè)，如果判讀為2+，可再行熒光原位雜交法檢測(cè)。然而，國(guó)內(nèi)醫(yī)院病理科因檢測(cè)水平參差不齊、主觀判讀因素及抗體原因，導(dǎo)致HER-2判讀為2+的檢測(cè)可重復(fù)性不高。因此，免疫組化法檢測(cè)乳腺癌患者HER-2表達(dá)添加質(zhì)控對(duì)照顯得尤為重要。本科室在多年標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)HER-2的基礎(chǔ)上，利用組織芯片的原理并借鑒成功經(jīng)驗(yàn)[3]，摸索出制作乳腺癌HER-2免疫組化簡(jiǎn)易芯片對(duì)照的方法，可使染色結(jié)果判讀更為客觀，效果良好，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集2019年1月～2020年4月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科存檔的乳腺癌手術(shù)標(biāo)本30例作為供體蠟塊，患者均為女性。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋。

1.2 試劑及設(shè)備全自動(dòng)免疫組化儀；抗HER-2兔單克隆抗體(克隆號(hào)4B5，即用型)、UrtalView HRP-Multimer DAB免疫組化檢測(cè)試劑盒、CC1(pH 9.0)修復(fù)液、Reaction Buffer緩沖液、EZ脫蠟液、LCS液蓋膜；正電荷黏附載玻片。

1.3 方法

1.3.1供體標(biāo)本的染色 所有供體蠟塊4 μm厚切片，使用正電荷黏附載玻片撈片，65 ℃烤片2 h；全自動(dòng)免疫組化儀按照預(yù)設(shè)程序染色(CC1修復(fù)液100 ℃ 修復(fù)30 min；一抗HER-2 37 ℃孵育32 min；二抗系統(tǒng)HRP-Multimer 37 ℃孵育8 min；DAB顯色37 ℃ 8 min；蘇木精復(fù)染)；染色結(jié)束后人工清洗玻片并脫水透明封固。

1.3.2結(jié)果判讀 HER-2陽(yáng)性定位于腫瘤細(xì)胞膜，結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)參考《乳腺癌HER2檢測(cè)指南(2019版)》[2]。

1.3.3供體蠟塊的選擇及簡(jiǎn)易芯片的制作 (1)從30例供體蠟塊中選擇染色效果最佳的-、1+、2+、3+各1例；(2)鏡下觀察切片，選定目標(biāo)區(qū)域并調(diào)取相對(duì)應(yīng)蠟塊，并用記號(hào)筆在蠟塊上對(duì)應(yīng)區(qū)域做標(biāo)記；(3)融解蠟塊，用刀片切取標(biāo)記的組織區(qū)域，切取組織區(qū)域，大小3 mm×3 mm，然后將切取的組織依次按照-、1+、2+、3+的順序包埋在同一蠟塊中；(4)在檢測(cè)乳腺癌中HER-2的表達(dá)時(shí)，可將上述簡(jiǎn)易芯片對(duì)照裱在切片一端，與待檢組織同時(shí)染色，染色程序同1.3.1。

2 結(jié)果

2.1 供體蠟塊HER-2免疫組化染色30例供體蠟塊免疫組化檢測(cè)結(jié)果：HER-2(3+)9例，HER-2(2+)6例，HER-2(1+)8例，HER-2(-)7例(圖1)。

圖1 HER-2的表達(dá)，EnVision法：A.3+；B.2+；C.1+；D.-

2.2 簡(jiǎn)易芯片的制作及應(yīng)用乳腺癌HER-2免疫組化簡(jiǎn)易芯片蠟塊制作較為便利、排列有序、體積小、識(shí)別度高；易于標(biāo)記和使用，可重復(fù)性強(qiáng)(使用完以后可再次挑選蠟塊制作)(圖2)。對(duì)制作完成后的簡(jiǎn)易芯片應(yīng)用于待檢組織HER-2免疫組化染色，芯片內(nèi)各點(diǎn)染色結(jié)果與初篩時(shí)供體蠟塊染色相同，無(wú)脫片、無(wú)移位(圖3)。

圖2 簡(jiǎn)易芯片蠟塊：A～D分別為HER-2 (3+)、(2+)、(1+)、(-) 圖3 簡(jiǎn)易芯片應(yīng)用于待檢組織：左側(cè)A～D為簡(jiǎn)易芯片，右側(cè)為待檢組織

3 討論

乳腺癌是女性高發(fā)惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率在我國(guó)呈逐年上升趨勢(shì)，且臨床復(fù)發(fā)率較高[4]。有研究表明，乳腺癌的發(fā)病與家族史、年齡、環(huán)境因素、內(nèi)分泌因子及乳腺癌相關(guān)基因調(diào)控因子均有一定的關(guān)系[5]，故對(duì)于乳腺癌患者，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療顯得尤為重要。近20年來，免疫學(xué)及分子生物技術(shù)的運(yùn)用給乳腺癌的早期診斷帶來希望，尤其是分子靶向藥物的研發(fā)和應(yīng)用使大量乳腺癌患者受益，乳腺癌的病死率較之前大大降低。因此，能否正確診斷乳腺癌并明確其類型，尤其是明確腫瘤相應(yīng)靶蛋白的表達(dá)，對(duì)于臨床正確選擇用藥極其重要。

近年來，針對(duì)治療HER-2陽(yáng)性乳腺癌的曲妥珠單抗赫賽汀在臨床上取得了較好的效果，一些新藥如帕妥珠單抗、拉帕替尼等也逐漸應(yīng)用于臨床。因此，正確而有效的檢測(cè)HER-2基因狀態(tài)或其蛋白是否高表達(dá)是乳腺癌患者治療用藥和預(yù)后評(píng)價(jià)的關(guān)鍵。2006年我國(guó)發(fā)布了《乳腺癌HER-2檢測(cè)指南》，截至2019年，專家多次對(duì)《乳腺癌HER-2檢測(cè)指南》進(jìn)行更新，在乳腺癌檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化及其判讀的客觀化等方面進(jìn)行指導(dǎo)，極大提高了我國(guó)的乳腺癌診斷水平。然而，我國(guó)乳腺癌HER-2的免疫組化檢測(cè)水平不一，發(fā)達(dá)地區(qū)地市級(jí)以上醫(yī)院病理科基本配備了全自動(dòng)免疫組化染色儀，能夠按照最新的《乳腺癌HER2檢測(cè)指南(2019版)》[2]標(biāo)準(zhǔn)采用推薦的抗體及方法標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)，并建立了本實(shí)驗(yàn)室的SOP(實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程)，但更多的基層醫(yī)院由于經(jīng)濟(jì)條件、技術(shù)水平等因素限制，并不能對(duì)HER-2的免疫組化進(jìn)行規(guī)范檢測(cè)。因此，為了保證診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，乳腺癌HER-2的免疫組化檢測(cè)需設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照，最好應(yīng)設(shè)立已明確的具有不同HER-2染色強(qiáng)度的對(duì)照，從而保證不同批次染色的客觀性。

本實(shí)驗(yàn)建立的HER-2簡(jiǎn)易芯片對(duì)照借助了組織芯片的原理，將HER-2不同陽(yáng)性狀態(tài)的組織整合到一個(gè)蠟塊中，在進(jìn)行免疫組化法檢測(cè)乳腺癌中未知HER-2水平時(shí)作為對(duì)照裱附在同一張切片上。該技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)傳統(tǒng)的組織芯片制作需要有組織芯片儀，制作復(fù)雜，且對(duì)技術(shù)人員熟練程度要求高，難以掌握。本實(shí)驗(yàn)不需要組織芯片儀，僅需要調(diào)取選擇蠟塊后融化，切割后重新包埋，簡(jiǎn)單，易于掌握，成本低，易推廣；(2)簡(jiǎn)易芯片中具備了HER-2(-)、(1+)、(2+)、(3+)四種狀態(tài)的對(duì)照組織，與傳統(tǒng)的單一陽(yáng)性對(duì)照相比，其更為客觀有效；(3)簡(jiǎn)易組織芯片構(gòu)成比較單一，排列整齊，便于觀察；(4)簡(jiǎn)易組織芯片體積小，可裱附在檢測(cè)片的任何一端，與檢測(cè)片同時(shí)檢測(cè)，在相同條件下檢測(cè)出染色結(jié)果，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性。同時(shí)，針對(duì)使用全自動(dòng)免疫組化儀的單位，也可以使用該簡(jiǎn)易芯片裱附在切片上任何區(qū)域，用來檢測(cè)機(jī)器在運(yùn)行時(shí)抗體混勻的狀態(tài)；(5)該簡(jiǎn)易芯片質(zhì)控樣本來源廣泛，可多次制作，在不同實(shí)驗(yàn)室之間可進(jìn)行室間質(zhì)控交流。

綜上所述，采用簡(jiǎn)易芯片法制作HER-2免疫組化對(duì)照，設(shè)計(jì)科學(xué)，簡(jiǎn)易可行，使免疫組化檢測(cè)結(jié)果判讀更為客觀可靠，值得推廣。