張 瑩，王 哲，楊向紅

乳腺癌是全球女性常見的惡性腫瘤之一，近年乳腺癌的發(fā)病率逐年升高，并呈年輕化趨勢[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，曲妥珠單抗對浸潤性乳腺癌組織中HER-2基因擴增患者的分子靶向治療取得較好療效，因此明確HER-2基因狀態(tài)對乳腺癌患者治療尤為重要[2]。目前HER-2檢測方法有免疫組化(immunohistochemistry, IHC)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、顯色原位雜交(chromogenic in situ hybridization, CISH)、雙色銀染原位雜交(dual-color in situ hybridization, DISH)等。本文采用IHC和FISH兩種方法進行HER-2蛋白表達和基因擴增檢測，分析其一致性；應用《乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)》[3](簡稱舊版指南)和《乳腺癌HER-2檢測指南(2019版)》[4](簡稱新版指南)進行判讀，探討新舊兩版指南對判讀結(jié)果的影響，旨在為臨床靶向用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年1月～2020年10月中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院存檔的乳腺浸潤性導管癌組織石蠟標本698例，其中手術(shù)切除標本575例，粗針穿刺標本123例。所有患者均為女性，年齡23～84歲，中位年齡53歲，術(shù)前均未接受新輔助治療。采用IHC和FISH法進行HER-2蛋白表達和基因擴增檢測，根據(jù)新舊兩版指南判讀標準，由兩位病理醫(yī)師閱片判讀。

1.2 方法

1.2.1IHC 標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)3 μm厚切片3張，分別進行HE、IHC、FISH染色。IHC使用HER-2/neu兔單克隆抗體(4B5，羅氏診斷公司)，Ventana BenchMark XT 全自動免疫組化儀檢測，每例標本均設有陰、陽性對照。

1.2.2FISH 使用HER-2基因擴增檢測試劑盒(北京金菩嘉公司)。(1)石蠟切片65 ℃烤片2 h，常規(guī)脫蠟。(2)預處理：100%乙醇脫二甲苯5 min，去離子水3 min，水煮20 min。(3)酶消化：37 ℃預熱的胃蛋白酶工作液中消化10 min。(4)梯度乙醇脫水。(5)變性及雜交：滴加探針混合液，蓋玻片，封片膠封固，85 ℃ 5 min，42 ℃孵育16～18 h。(6)雜交后處理：46 ℃ 2×SSC洗滌5 min，46 ℃ 0.1%NP-40洗滌2 min，70%乙醇3 min，暗處自然干燥。(7)DAPI(4′6-二脒基-2-苯基吲哚)復染、封片。(8)熒光顯微鏡下判讀。

1.3 結(jié)果判讀IHC結(jié)果判讀：根據(jù)舊版指南無染色或≤10%的浸潤癌細胞呈不完整的、微弱的細胞膜染色為0；>10%的浸潤癌細胞呈不完整的、微弱的細胞膜染色為1+；>10%的浸潤癌細胞呈弱～中等強度的完整細胞膜染色，或≤10%浸潤癌細胞呈強而完整的細胞膜染色為2+；>10%的浸潤癌細胞呈強而完整且均勻的細胞膜染色為3+。新版指南與舊版指南判讀結(jié)果基本相同。

FISH結(jié)果判讀：在低倍鏡下觀察整張FISH切片，判斷檢測質(zhì)量以及是否存在HER-2基因擴增的異質(zhì)性。找到至少2個浸潤癌區(qū)域，隨機計數(shù)30個浸潤癌細胞中的雙色信號(要求細胞核大小一致、核邊界完整、DAPI染色均一、細胞核無重疊、信號清晰)。雙探針FISH判讀標準詳見圖1、2。

圖1 舊版指南HER-2雙探針FISH檢測判讀標準：a表示均質(zhì)、連續(xù)的浸潤細胞，且占浸潤癌的10%以上

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，對IHC與FISH法檢測的HER-2蛋白表達與基因擴增結(jié)果進行Kappa一致性分析及Spearman等級相關(guān)分析，本實驗以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 舊版指南判讀在698例乳腺浸潤性導管癌患者中，IHC法進行HER-2蛋白檢測，合計檢測HER-2(0)、HER-2(1+)患者116例，檢出率為16.6%(116/698)；HER-2(2+)患者402例，檢出率為57.6%(402/698)；HER-2(3+)患者180例，檢出率25.8%(180/698)(圖3)。

圖3 HER-2蛋白表達，Ventana Ultraview DAB 法：A.HER-2(0)；B.HER-2(1+)；C.HER-2(2+)；D.HER-2(3+)

FISH法進行HER-2基因擴增檢測，HER-2基因擴增陽性284例，檢出率為40.7%(284/698)；HER-2基因擴增陰性364例，檢出率為52.1%(364/698)；HER-2基因擴增結(jié)果不確定50例，檢出率為7.2%(50/698)。

圖2 新版指南HER-2雙探針FISH檢測判讀標準：a表示IHC檢測HER-2(3+)呈陽性；HER-2(0)、HER-2(1+)、HER-2(2+)均呈陰性

2.2 新版指南判讀在698例乳腺浸潤性導管癌中，F(xiàn)ISH法檢出HER-2基因擴增陽性279例，檢出率為40.0%(279/698)；FISH法檢測HER-2基因擴增陰性419例，檢出率為60.0%(419/698)。IHC法檢測HER-2蛋白表達結(jié)果與舊版指南判讀結(jié)果一致。

2.3 新版與舊版指南判讀分析與舊版指南判讀結(jié)果相比，新版FISH法檢測HER-2基因擴增陽性由40.7%降至40.0%，F(xiàn)ISH法檢測HER-2基因擴增結(jié)果不確定由7.2%降至0，F(xiàn)ISH法檢測HER-2基因擴增陰性由52.1%升至60.0%。在698例FISH法檢測HER-2基因擴增結(jié)果中，642例新舊兩版判讀結(jié)果相同，一致率為92.0%(642/698)，56例兩版判讀結(jié)果不同(8.0%，56/698)。56例中舊版指南FISH法檢測HER-2基因擴增陽性而新版指南為陰性的6例，舊版指南FISH法檢測HER-2基因擴增結(jié)果不確定而新版指南為陽性1例，舊版指南FISH法檢測HER-2基因擴增不確定而新版指南陰性49例(圖4)。

圖4 FISH法檢測HER-2基因擴增結(jié)果(HER-2呈紅色，CEP17呈綠色)：A.HER-2信號連接成簇；B.HER-2/CEP17比值≥2.0，平均HER-2拷貝數(shù)≥4.0信號/細胞；C.HER-2/CEP17比值≥2.0，平均HER-2拷貝數(shù)<4.0信號/細胞；D.HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷貝數(shù)≥6.0信號/細胞；E.HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷貝數(shù)≥4.0且<6.0信號/細胞；F.HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷貝數(shù)<4.0信號/細胞

2.4 IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的一致性分析根據(jù)舊版指南判讀，IHC法檢測HER-2蛋白表達0、1+與FISH法檢測HER-2基因擴增陰性符合率為88.8%(103/116)，IHC法檢測HER-2蛋白表達2+與FISH法檢測HER-2基因擴增陽性符合率為27.9%(112/402)，IHC法檢測HER-2蛋白表達3+與FISH法檢測HER-2基因擴增陽性符合率為92.8%(167/180)。IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的總一致率為54.7%(382/698)，結(jié)果存在一致性(Kappa=0.277，P<0.001)，且呈正相關(guān)(r=0.608，P<0.001，表1)。

表1 舊版指南IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的一致性分析

根據(jù)新版指南判讀，IHC法檢測HER-2蛋白表達0、1+與FISH法檢測HER-2基因擴增陰性符合率為97.4%(113/116)，IHC法檢測HER-2蛋白表達2+與FISH法檢測HER-2基因擴增陽性符合率為26.9%(108/402)，IHC法檢測HER-2蛋白表達3+與FISH法檢測HER-2基因擴增陽性符合率為93.3%(168/180)。IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的總一致率為55.7%(389/698)，結(jié)果存在一致性(Kappa=0.251，P<0.001)，且呈正相關(guān)(r=0.641，P<0.001，表2)。

表2 新版指南IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的一致性分析

3 討論

HER-2基因?qū)儆贓GFR家族成員之一，主要通過與家族其他成員形成異二聚體與配體結(jié)合，激活下游信號傳導途徑，從而促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌中均檢測出HER-2基因擴增或HER-2蛋白的過表達，13%～20%的乳腺癌患者HER-2檢測陽性，并有部分患者從分子靶向治療中獲益[8-10]。因此，明確HER-2基因狀態(tài)對乳腺癌患者的個體化治療尤為重要。

根據(jù)新版指南判讀，本組FISH法檢測HER-2基因擴增陽性檢出率為40.0%，IHC法檢測HER-2蛋白表達3+檢出率為25.8%，IHC法檢出率與文獻報道基本一致[11-12]。由于FISH法檢測參照的判讀標準不同，導致文獻報道的FISH法檢測HER-2基因擴增陽性檢出率不一[11-13]。本組通過對698例浸潤性乳腺癌患者的IHC和FISH結(jié)果以舊版指南再判讀發(fā)現(xiàn)，新版指南結(jié)合了HER-2/CEP17比值、平均HER-2拷貝數(shù)和IHC結(jié)果綜合評估，取消了FISH法檢測HER-2基因擴增的不確定結(jié)果，使不確定結(jié)果由7.2%降至0。FISH法檢測HER-2基因擴增陽性由40.7%降至40.0%，F(xiàn)ISH法檢測HER-2基因擴增陰性由52.1%升至60.0%，為臨床提供了更明確的HER-2基因狀態(tài)。此外在698例中，有56例新舊兩版指南判讀結(jié)果不同，其中6例為HER-2/CEP17比值≥2，平均HER-2拷貝數(shù)<4.0信號/細胞，在新版指南中FISH結(jié)果為陰性，現(xiàn)有的臨床試驗數(shù)據(jù)中，缺乏充分依據(jù)顯示此部分患者能從靶向治療中獲益[14-15]，新版指南判讀結(jié)果與臨床試驗數(shù)據(jù)相符。另有50例為HER-2/CEP17比值<2，平均HER-2拷貝數(shù)≥4.0且<6.0信號/細胞，根據(jù)新版指南判讀，1例結(jié)合IHC 3+結(jié)果，F(xiàn)ISH結(jié)果為陽性，49例結(jié)合IHC 0、1+、2+結(jié)果，F(xiàn)ISH結(jié)果為陰性。此部分患者能否從靶向治療中獲益目前尚不確定，需要更充分的循證醫(yī)學依據(jù)[16-17]。

本組結(jié)果顯示，根據(jù)新舊兩版指南判讀，IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增結(jié)果均存在一致性(Kappa=0.277，P<0.001；Kappa=0.251，P<0.001)，且均呈正相關(guān)(r=0.608，P<0.001；r=0.641，P<0.001)，與文獻報道一致[18-19]。經(jīng)對比分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)新版指南判讀，IHC法檢測HER-2 (0、1+)、(3+)與FISH法檢測HER-2基因擴增結(jié)果的符合率明顯增加(97.4%，93.3%)，IHC法檢測HER-2 (2+)與FISH法檢測結(jié)果符合率降低(26.9%)，IHC與FISH法檢測的總一致率略有提高(55.7%)。新版指南中部分結(jié)果結(jié)合IHC綜合判讀，提高了IHC與FISH法檢測結(jié)果的一致性。同時本組結(jié)果也進一步驗證了指南中提出的，IHC法檢測HER-2(0)、(1+)判為陰性，HER-2(3+)判為陽性，HER-2 (2+)一致率較低，需應用FISH法進行HER-2基因擴增狀態(tài)檢測，為臨床提供多角度更精準的靶向治療依據(jù)。此外，指南中還提出所有乳腺原發(fā)性浸潤性癌均應進行HER-2檢測，只要能獲取腫瘤組織，對復發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶也應進行HER-2檢測。本組698例均為原發(fā)性浸潤性乳腺癌，對復發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶HER-2檢測結(jié)果需跟蹤患者后續(xù)治療以進一步分析。

此外，在595例計數(shù)17號染色體著絲粒CEP17信號中發(fā)現(xiàn)平均CEP17拷貝數(shù)≥3信號/細胞者有128例(21.5%，28/595)。近年有研究顯示整條17號染色體的多體罕見，CEP17的增加并不能代表整條17號染色體多體，部分乳腺癌中存在HER-2基因與著絲粒的共擴增[20]。17號染色體的異常與乳腺癌的預后或靶向治療是否相關(guān)，尚未有明確報道，有待于進一步分析。

綜上所述，新舊兩版指南IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增結(jié)果均存在一致性，且兩者均呈正相關(guān)。新版指南結(jié)合HER-2/CEP17比值、平均HER-2拷貝數(shù)和IHC結(jié)果綜合評估，取消了FISH法檢測HER-2基因擴增的不確定結(jié)果，使其陰性率有所增加，為臨床提供了更完善的靶向治療依據(jù)。