楊佳佳，李 濤，周明莉，趙 勇，梁樹梅，張彥懿，黃江渝△

四川省成都市第三人民醫(yī)院：1.臨床醫(yī)學(xué)檢驗部；2.婦產(chǎn)科；3.體檢部，四川成都 610031

解脲脲原體(UU)和沙眼衣原體(CT)是引起人類泌尿生殖道感染常見的兩種病原體，屬于性傳播疾病病原體，感染后可導(dǎo)致女性生殖道炎及盆腔炎，與自然流產(chǎn)、宮外孕、早產(chǎn)、不孕癥等不良孕產(chǎn)結(jié)局密切相關(guān)，嚴(yán)重威脅育齡期女性生殖健康[1-3]。近年來，女性生殖道UU、CT感染率逐年增高，研究感染與自然流產(chǎn)、宮外孕、早產(chǎn)等不良孕產(chǎn)及不育不孕的相關(guān)性也越來越受到重視。隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展和提高，目前已有多種方法檢測上述病原體，熒光探針聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)廣泛應(yīng)用于UU-DNA、CT-DNA的臨床檢測[4-5]，目前有些實驗室開始采用實時熒光核酸恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)(SAT)檢測UU-RNA、CT-RNA[6]。本研究收集本院婦產(chǎn)科2018年6月至2020年5月收治的不良孕產(chǎn)患者的資料和宮頸分泌物，使用FQ-PCR和SAT分別檢測宮頸分泌物的UU-DNA、CT-DNA與UU-RNA、CT-RNA，并對UU、CT感染與不良孕產(chǎn)的相關(guān)性進(jìn)行分析探討，以指導(dǎo)臨床診斷和治療。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2020年5月本院98例不良孕產(chǎn)和不孕癥女性患者作為觀察組，年齡19～47歲，平均(29.86±5.02)歲；其中自發(fā)性流產(chǎn)62例，異位妊娠16例，不孕癥20例。另選取已婚體檢健康女性38例作為對照組，年齡23～40歲，平均(30.58±4.04)歲。2組研究對象年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有研究對象均知情并簽署知情同意書。

1.2標(biāo)本采集 所有標(biāo)本均為女性宮頸分泌物。采用無菌窺陰器，充分顯露宮頸，無菌棉拭子伸入宮頸口1～2 cm，旋轉(zhuǎn)1周，停留5～10 s后取出，將棉拭子置于無菌試管，密閉送檢。

1.3儀器與試劑 DA7600實時熒光定量PCR儀(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)及FQ-PCR用于UU-DNA和CT-DNA檢測。LC COBAS Z480實時熒光定量PCR儀(羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司)、MK-20干式恒溫儀(杭州奧盛儀器有限公司)及SAT用于UU-RNA和CT-RNA檢測。PCR-熒光探針法UU和CT核酸檢測試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，RNA恒溫擴(kuò)增法UU和CT核酸檢測試劑盒購自上海仁度生物科技有限公司，試劑盒均在有效期內(nèi)，均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4方法

1.4.1FQ-PCR檢測UU-DNA和CT-DNA 用1 mL無菌生理鹽水將棉拭子充分洗脫后擠干棉拭子，將全部液體轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min；去上清液，沉淀，加入1 mL無菌生理鹽水充分混勻，12 000 r/min離心5 min；去上清液，沉淀，加入50 μL DNA提取液充分振蕩混勻，100 ℃恒溫處理(10±1)min，12 000 r/min離心5 min后備用。同時設(shè)置陰性、臨界陽性、強(qiáng)陽性對照和外部質(zhì)控品。將2 μL上清液加入PCR反應(yīng)液中，93 ℃ 2 min，按93 ℃ 45 s到55 ℃ 60 s做10個循環(huán)，然后93 ℃ 30 s到55 ℃ 45 s做30個循環(huán)。結(jié)果判讀嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.4.2SAT檢測UU-RNA和CT-RNA 利用磁珠分離方法制備RNA模板，按照試劑盒說明書，設(shè)置陰性和陽性對照。取400 μL加有保存液的分泌物標(biāo)本和100 μL核酸提取液混勻，60 ℃恒溫5 min，室溫放置10 min，置于磁珠分離器上靜置5 min，棄去液體，加入洗滌液洗滌2次，加入40 μL核酸反應(yīng)液，充分混勻。取30 μL轉(zhuǎn)移到反應(yīng)管中，60 ℃ 10 min，42 ℃ 5 min，加入42 ℃預(yù)熱的SAT酶液，42 ℃實時恒溫擴(kuò)增 40 min。質(zhì)量控制：按試劑說明書定期用臨界弱陽性對照進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，dt陽性對照≤dt臨界弱陽性對照≤35；dt陰性對照無數(shù)值或為40；否則，實驗視為無效需重新進(jìn)行。結(jié)果判讀嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計數(shù)資料以頻數(shù)、率表示，組間比較采用χ2檢驗或F確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組研究對象宮頸分泌物中UU-DNA和CT-DNA檢出情況 觀察組UU-DNA、CT-DNA檢出率和總檢出率高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在觀察組和對照組中，UU-DNA檢出率均明顯高于CT-DNA，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組研究對象宮頸分泌物中UU-DNA和CT-DNA檢出情況比較[n(%)]

2.22組不同年齡段宮頸分泌物中UU-DNA和CT-DNA檢出情況 在<35歲年齡段，觀察組UU-DNA、CT-DNA檢出率和總檢出率均高于對照組，觀察組CT-DNA檢出率也高于同組≥35歲年齡段，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在≥35歲年齡段，觀察組UU-DNA檢出率和總檢出率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組不同年齡段宮頸分泌物中UU-DNA和CT-DNA檢出情況比較[n(%)]

2.3不同臨床癥狀患者UU-DNA、CT-DNA檢測結(jié)果 自發(fā)性流產(chǎn)、異位妊娠和不孕癥患者UU-DNA、CT-DNA檢出率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同臨床癥狀患者UU-DNA、CT-DNA檢測結(jié)果[n(%)]

2.42組FQ-PCR和SAT檢測結(jié)果比較 觀察組UU-DNA與UU-RNA、CT-DNA與CT-RNA檢出率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對照組UU-RNA檢出率明顯高于UU-DNA，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組FQ-PCR和SAT檢測結(jié)果比較[n(%)]

3 討 論

育齡期女性性生活活躍，生殖道易感UU、CT等病原微生物，病原體可沿著生殖道上行蔓延，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎及輸卵管損傷，引起盆腔廣泛粘連，對女性生殖道健康造成嚴(yán)重影響，并可導(dǎo)致不孕和流產(chǎn)等不良后果[7-9]。女性感染UU、CT后常常無癥狀或癥狀輕微，從而忽略就醫(yī)診治，導(dǎo)致病情不良進(jìn)展。目前，臨床上通過各種實驗檢查，可明確UU、CT等病原體感染，指導(dǎo)臨床診斷及治療。

本研究采用FQ-PCR對UU-DNA和CT-DNA進(jìn)行檢測，觀察組UU-DNA、CT-DNA檢出率和總檢出率均高于對照組，而且2組中UU-DNA檢出率均明顯高于CT-DNA，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這與近年報道一致[10-12]。臨床上常常將35歲及其以上孕產(chǎn)婦稱為高齡產(chǎn)婦，故在本研究中，以35歲為年齡劃分界限，結(jié)果顯示，不論在哪個年齡段，觀察組UU-DNA檢出率和總檢出率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而觀察組CT-DNA檢出率在<35歲年齡段不僅高于同齡段對照組(P<0.05)，還高于同組≥35歲年齡段的不良孕產(chǎn)患者。這可能是因為<35歲女性正值育齡較佳的階段，性行為活躍，增加了CT感染的概率[13]。

不同臨床癥狀的患者，如自發(fā)性流產(chǎn)、異位妊娠和不孕癥患者中UU-DNA與CT-DNA檢出率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明不良孕產(chǎn)和不孕癥患者的感染概率相差不大，但是由于癥狀不明顯，這種感染在不孕癥患者中往往是潛伏性的，不易發(fā)現(xiàn)。有文獻(xiàn)報道，經(jīng)治療后UU和CT轉(zhuǎn)陰的患者，妊娠率明顯高于未轉(zhuǎn)陰者[14]，故對無癥狀或癥狀不明顯的育齡期婦女進(jìn)行UU和CT檢測，具有重要意義。

本研究使用FQ-PCR和SAT分別檢測病原微生物的DNA和RNA。SAT是將實時熒光檢測技術(shù)和核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合的一種新型RNA檢測技術(shù)，具有很高的靈敏度和特異性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，UU核酸陽性檢出率較高，觀察組中UU-DNA與UU-RNA檢出率相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與石瑛等[16]報道一致。觀察組中CT-DNA與CT-RNA檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但在對照組中，UU-RNA檢出率明顯高于UU-DNA(P<0.05)。說明在自發(fā)性流產(chǎn)、異位妊娠和不孕癥患者中，F(xiàn)Q-PCR和SAT兩種技術(shù)對UU和CT的檢出率相當(dāng)，但在無癥狀的體檢健康人群中，由于SAT的靈敏度高[17-18]，UU-RNA的檢出率更高。因此，SAT在無癥狀感染人群中監(jiān)測生殖道UU感染的優(yōu)勢較明顯。

綜上所述，不良孕產(chǎn)患者宮頸分泌物UU檢出率較高。FQ-PCR和SAT檢測均能為臨床診斷UU和CT感染提供依據(jù)。在無癥狀感染人群中，SAT檢測UU更具優(yōu)勢，有利于臨床對UU感染者早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療，對保障婦女生殖道健康、降低不孕不育發(fā)生率具有重要意義。