應(yīng)姍珊，羅 嵐，鄧杰倫，王遠(yuǎn)芳，李冬冬

四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗醫(yī)學(xué)科，四川成都 610041

神經(jīng)梅毒(NS)是梅毒螺旋體(TP)感染累及神經(jīng)系統(tǒng)時出現(xiàn)腦膜、大腦、血管或脊髓等損傷的一組臨床綜合征，但NS目前確診較困難，容易被漏診與誤診[1-2]。2020版《梅毒、淋病和生殖道沙眼衣原體感染診療指南》推薦NS腦脊液(CSF)檢查首選試驗為梅毒性病研究實驗室試驗(VDRL)和熒光螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS)，相對于廣泛用于臨床的電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)，F(xiàn)TA-ABS和VDRL在我國醫(yī)院開展較少[3]。本研究使用2種方法(ECLIA和FTA-ABS)來檢測CSF中3類梅毒特異性抗體[梅毒特異性總抗體(anti-TP)，梅毒特異性抗體免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)]，探索ECLIA和FTA-ABS在NS CSF檢測中作為初篩試驗應(yīng)用的價值[4]。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2020年1月于本院就診的梅毒確診患者124例作為研究對象，患者多就診于神經(jīng)內(nèi)科或感染科，多伴有NS相關(guān)神經(jīng)癥狀或臨床診斷確診/懷疑NS。以CSF VDRL結(jié)果作為診斷NS的金標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為NS組和非NS組。NS組納入標(biāo)準(zhǔn)：滿足中國疾病預(yù)防控制中心發(fā)布的《梅毒、淋病和生殖道沙眼衣原體感染診療指南(2020年)》[3]NS疑似條件且CSF VDRL陽性的患者。非NS組納入標(biāo)準(zhǔn)：血清梅毒初篩、梅毒血清學(xué)試驗(TURST)及梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(TPPA)皆陽性，而CSF VDRL陰性的患者。本研究經(jīng)本院生物醫(yī)學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.2方法 收集NS組和非NS組患者CSF標(biāo)本，排除明顯血性的CSF，CSF性狀均正常。將標(biāo)本置于-80 ℃標(biāo)本冰箱保存?zhèn)溆?。質(zhì)量控制嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行，試驗操作步驟和結(jié)果判讀方法如下。

1.2.1采用VDRL檢測梅毒非特異性抗體 相關(guān)試劑來自美國BD公司。將CSF標(biāo)本從冰箱取出后置于室溫下復(fù)溫30 min，在反應(yīng)玻片2～4孔加入50 μL 0.9%NaCl溶液，在第1、2孔加入50 μL待測標(biāo)本，將第2孔標(biāo)本與0.9%NaCl溶液輕輕吹打混勻并吸取50 μL到第3孔，重復(fù)操作，直到最后一孔吸取50 μL標(biāo)本棄用完成稀釋?；靹蚩乖瓚乙?每日制備新鮮抗原懸液)并在每個反應(yīng)孔垂直懸空加入10 μL。將反應(yīng)玻片放置于旌派儀器有限公司(上海)梅毒旋轉(zhuǎn)振蕩器XK96-9上，180 r/min振蕩4 min。使用Olymbus公司(日本)光學(xué)顯微鏡BX43在10倍物鏡下觀察結(jié)果。結(jié)果判讀：根據(jù)說明書將結(jié)果分為中-大團(tuán)陽性(R)、小-弱團(tuán)陽性(WR)和無凝集或非常輕微的陽性(NR)，第1次檢測標(biāo)本最高稀釋倍數(shù)為1∶8，如果最后一孔依然為陽性則繼續(xù)稀釋，最后以顯微鏡中結(jié)果為R的最大滴度為最終結(jié)果。

1.2.2采用ECLIA檢測CSF中anti-TP CSF標(biāo)本從冰箱取出后置于室溫下復(fù)溫30 min，去蓋后上架編號并使用德國Roche公司Cobas e801電化學(xué)發(fā)光免疫自動分析儀檢測，檢測使用的配套試劑購自德國Roche公司。結(jié)果判讀：記錄每個標(biāo)本臨界值指數(shù)(COI)值，采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析COI值的最佳臨界值，COI值<最佳臨界值為無反應(yīng)性即anti-TP抗體陰性，COI值≥最佳臨界值為有反應(yīng)性即anti-TP抗體陽性。

1.2.3采用FTA-ABS檢測CSF中IgG、IgM 相關(guān)試劑來自德國歐蒙公司。按照試劑說明書要求準(zhǔn)備磷酸鹽緩沖液(PBS)-吐溫緩沖劑、FTA-ABS吸附劑和RF吸附劑。標(biāo)本復(fù)溫后使用FTA-ABS吸附劑稀釋(IgM檢測還需RF吸附劑稀釋)并放置于干式恒溫金屬浴37 ℃孵育30 min。經(jīng)加樣、溫育、沖洗、浸泡，加二抗再重復(fù)溫育、沖洗、浸泡，最后封片，使用熒光顯微鏡EUROStar Ⅲ Plus判讀熒光模型。結(jié)果判讀：質(zhì)控芯片上代表相應(yīng)抗體的微點出現(xiàn)陽性，反應(yīng)區(qū)全片出現(xiàn)均勻的TP發(fā)光即為陽性；質(zhì)控芯片上代表相應(yīng)抗原微點出現(xiàn)陽性，且反應(yīng)區(qū)不出現(xiàn)熒光或出現(xiàn)非特異性熒光為陰性；質(zhì)控芯片無熒光，檢測結(jié)果不可靠應(yīng)重新試驗。

1.2.4清蛋白商(QAlb) 回顧性分析患者實驗室檢查結(jié)果，選取留存標(biāo)本同日患者CSF、血清清蛋白檢查結(jié)果，并按照公式[QAlb=CSF清蛋白/血清清蛋白]計算QAlb。根據(jù)各年齡段參考值進(jìn)行結(jié)果判讀：0～15歲，QAlb<5.0×10-3；>15～40歲，QAlb<6.5×10-3；>40歲，QAlb<8.0×10-3。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 使用EXCEL 365統(tǒng)計數(shù)據(jù)，IBM SPSS Statistics 22.0和GraphPad Prism 8.0.2.263軟件處理分析數(shù)據(jù)，MedCalc 15.2.2繪圖。計數(shù)資料以頻數(shù)、率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用ROC曲線及曲線下面積(AUC)分析CSF梅毒特異性抗體檢測方法對NS的診斷效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1梅毒患者CSF VDRL檢測結(jié)果 NS組患者共36例，其中女8例，男28例，2例伴人類免疫缺陷病毒(HIV)感染；非NS組患者共88例，其中女40例，男48例，5例伴人類免疫缺陷病毒(HIV)感染。

2.22組患者CSF中梅毒特異性抗體的陽性檢出率比較 NS組CSF中anti-TP、IgM、IgG的陽性檢出率高于非NS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者CSF中梅毒特異性抗體的陽性檢出率比較[n(%)]

2.3CSF中3種梅毒特異性抗體檢測對NS的診斷效能 繪制anti-TP、IgM、IgG診斷NS的ROC曲線，ECLIA檢測anti-TP診斷NS的最佳臨界值為19.1，AUC為0.964(95%CI：0.914～0.989)，特異度為94.44%，靈敏度為92.05%，約登指數(shù)為0.864 9。以COI>19.1為陽性，ECLIA檢測anti-TP診斷NS的AUC大于FTA-ABS檢測IgM和IgG診斷NS的AUC(P<0.05)。見表2。

表2 3種梅毒特異性抗體對NS的診斷效能

2.4VDRL滴度與CSF中IgM陽性結(jié)果的相關(guān)性 隨著VDRL滴度上升，CSF中IgM結(jié)果呈陽性的患者比例增加，但發(fā)現(xiàn)1例非NS患者CSF IgM結(jié)果陽性，見表3。

表3 VDRL不同滴度CSF中FTA-ABS-IgM陽性分布情況

2.5QAlb不同的CSF中IgM結(jié)果分布情況 排除年齡和CSF、血清清蛋白數(shù)據(jù)不全標(biāo)本后，納入統(tǒng)計數(shù)據(jù)的患者NS組21例，非NS組65例。QAlb與CSF中IgM結(jié)果聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，QAlb結(jié)果在NS組和非NS組分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 QAlb不同的CSF中IgM結(jié)果分布情況比較(n)

3 討 論

多數(shù)患者神經(jīng)系統(tǒng)被TP侵犯時無癥狀，無法提示臨床醫(yī)生懷疑NS感染，易錯過NS早期診斷和治療的時機(jī)[5]。在梅毒發(fā)展到Ⅱ、Ⅲ期時，TP數(shù)量減少但破壞力增強(qiáng)，預(yù)后變差[6]。血腦屏障功能正常時，血中的IgM等大分子蛋白質(zhì)無法進(jìn)入CSF，CSF中的IgM皆由鞘內(nèi)免疫反應(yīng)合成，提示NS活動性感染；而血腦屏障異常時，CSF中的IgM可能來源于血液或鞘內(nèi)合成，無法判斷是否為NS活動性感染。本試驗使用QAlb來評價血腦屏障功能完整性，以15歲和40歲為節(jié)點，不同年齡段QAlb參考范圍不同，QAlb也可提示神經(jīng)系統(tǒng)疾病感染類型，QAlb輕度升高(QAlb<20×10-3)常見于急、慢性病毒感染，多發(fā)性硬化，NS等[7-8]。

在NS的CSF檢測中，普遍認(rèn)為CSF VDRL具有較高的特異度，但其靈敏度較低[9]。2010年美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)發(fā)布的性病治療指南認(rèn)為CSF VDRL陽性是實驗室確診NS的必要條件[10]，并且只有在確保CSF標(biāo)本無明顯的血液污染的前提下，VDRL陽性才具有臨床價值。但VDRL的標(biāo)本檢測有效時限短且試劑需要提前配置、試劑盒購買困難等缺點限制了其臨床檢驗的實用性。根據(jù)《梅毒、淋病和生殖道沙眼衣原體感染診療指南(2020年)》[3]NS疑似病例與確診標(biāo)準(zhǔn)，NS確診需綜合臨床表現(xiàn)、血清學(xué)檢查、CSF蛋白、白細(xì)胞以及梅毒抗體檢測綜合判定。FTA-ABS操作較復(fù)雜，雖歐蒙公司已有間接免疫熒光法自動化儀器，但仍需人工讀片。FTA-ABS可分別檢測梅毒特異性抗體IgG和IgM，具有作為NS CSF篩查試驗的潛質(zhì)。根據(jù)目前的研究，CSF梅毒血清學(xué)試驗的靈敏度高，特異度差，很難直接作為確診依據(jù)，F(xiàn)TA-ABS和VDRL主要用于陰性排除[11]。

本研究對124例梅毒患者進(jìn)行了CSF VDRL檢查，確診NS 36例，NS發(fā)生率為29.0%。但VDRL靈敏度低，存在一定的假陰性率。ECLIA檢測anti-TP是目前廣泛應(yīng)用于臨床的梅毒初篩指標(biāo)，方法簡單且大多數(shù)醫(yī)院可進(jìn)行全自動檢測。該方法靈敏度較高，根據(jù)ROC曲線分析，當(dāng)臨界值為19.1時ECLIA對NS檢測的診斷效能最佳，AUC為0.964(95%CI：0.914～0.989)，特異度為94.44%，靈敏度為92.05%，約登指數(shù)為0.864 9。但本研究樣本數(shù)量不足以證明19.1的最佳臨界值具有代表性，后續(xù)需擴(kuò)大研究樣本數(shù)補(bǔ)充驗證ECLIA在CSF中的最佳COI值，可嘗試設(shè)置靈敏度更高的發(fā)光值為臨界值。

FTA-ABS作為特異度較高的一種權(quán)威的CSF梅毒特異性抗體檢測試驗，與免疫印跡法(WB)相比特異度相近，但成本更低，臨床應(yīng)用價值更高[12]。本研究中共有11例CSF標(biāo)本IgM和IgG檢測均陽性，IgM陽性檢出率明顯低于IgG。經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TA-ABS檢測IgG可以很好地用于區(qū)別NS和非NS，靈敏度和特異度都較高，分別為97.22%和78.41%，可以考慮作為NS的篩查指標(biāo)。FTA-ABS檢測IgM的陽性檢出率低，靈敏度僅有30.56%，但特異度較高達(dá)98.86%。而IgG可以穿過血腦屏障，無法區(qū)分CSF中IgG是否由鞘內(nèi)合成，可以用抗體特異性指數(shù)來反映病原特異性抗體是否為鞘內(nèi)產(chǎn)生[13-14]。

血腦屏障功能正常時，CSF中的IgM只能鞘內(nèi)合成，理論上CSF IgM診斷NS較準(zhǔn)確。IgM只在梅毒活動期存在，不能提示既往梅毒感染，所以理論上CSF IgM在提示既往感染時存在一定的假陰性率，需要和IgG檢測聯(lián)合使用。VDRL滴度高的標(biāo)本IgM陽性檢出率比VDRL滴度低的標(biāo)本更高。

QAlb正常時，CSF IgM結(jié)果陽性則認(rèn)為NS可能性較高，CSF IgM結(jié)果陰性則認(rèn)為NS可能性較低。QAlb升高時，血腦屏障功能完整性被破壞，此時若IgM檢測結(jié)果為陽性，無法判斷出CSF中IgM是否由鞘內(nèi)合成，此時可以參考抗體特異性指數(shù)進(jìn)行診斷。當(dāng)QAlb升高且CSF IgM為陰性時，存在兩種可能：(1)NS既往感染患者，血清及CSF中不含有或含有少量IgM；(2)非NS既往感染患者，血清梅毒抗體IgM水平低或無。

非NS組中有1名患者CSF VDRL檢測陰性，但使用FTA-ABS檢測CSF IgG與IgM結(jié)果皆為弱陽性，ECLIA檢測anti-TP結(jié)果為陽性，患者CSF TPPA滴度1∶320，CSF TRUST陰性，查閱患者病歷后發(fā)現(xiàn)該患者同時伴有HIV感染，CSF中未查見白細(xì)胞，且無神經(jīng)系統(tǒng)受損臨床癥狀，不符合NS疑似標(biāo)準(zhǔn)，排除其感染可能，該患者CSF IgG升高可能與血清TP IgG高滴度有關(guān)(血清TPPA為1∶10 240)，該患者無CSF生化結(jié)果，不能判斷QAlb是否升高，CSF中的IgM可能由血清產(chǎn)生。

綜上所述，ECLIA檢測CSF中anti-TP診斷NS的靈敏度較高，自動化程度高，操作簡單，可以考慮作為初篩試驗，但本研究樣本通量不大，計算的COI值需要更多數(shù)據(jù)驗證，具體的應(yīng)用效能評價需進(jìn)一步研究；FTA-ABS檢測CSF IgG診斷NS的靈敏度和特異度都較好，可以考慮作為陰性排除試驗，但成本較高，手工操作繁復(fù)。FTA-ABS檢測CSF IgM診斷NS的靈敏度低，但對NS的現(xiàn)癥感染具有提示意義，排除血腦屏障損傷后診斷NS的結(jié)果更可信，但由于試驗結(jié)果的熒光強(qiáng)度多數(shù)較低，人工判讀差異較大，易漏診。