◎ 陳啟鐫,廖文彬
(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,廣東 佛山 528300)
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是生命體中具有活性物質(zhì)的抗氧化酶,能消除新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì),持續(xù)向人體補(bǔ)充SOD,具有特殊的抗衰老作用,其主要作用是能在生物氧化過程清除自由基[1],將超氧陰離子自由基(O2-)轉(zhuǎn)化為過氧化氫,可作為藥用酶[2]預(yù)防和治療由自由基引起的各類疾病。
超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化物酶和過氧化氫酶是生物細(xì)胞的保護(hù)系統(tǒng)[3],超氧化物歧化酶主要作用是清除細(xì)胞中的超氧陰離子自由基,從而保護(hù)生物膜的生物大分子結(jié)構(gòu)免受氧化損傷[4]。而谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化物酶(CAT)和過氧化物酶(POD)分別清除脂質(zhì)和細(xì)胞中的過氧化物和過氧化氫[5]。自19世紀(jì)以來,SOD的研究一直被國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、食品等領(lǐng)域的學(xué)者廣泛關(guān)注[6]。近年來,SOD在抗衰老、抗炎、抗癌等機(jī)理研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。
SOD活性測(cè)定方法已較成熟,相關(guān)活性研究較多。劉銀萍[7]以牡丹品種“洛陽(yáng)紅”為研究對(duì)象,研究其花發(fā)育8個(gè)時(shí)期花瓣的3種抗氧化酶SOD、POD和CAT活性變化,結(jié)果表明3種抗氧化酶通過協(xié)同作用快速清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的O2-,花瓣的衰老受多因素的共同影響,其中抗氧化酶的參與延緩了花瓣的衰老進(jìn)程。潘百明等[8]采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定了紫茄子超氧化物歧化酶(SOD)活性,并對(duì)影響SOD活性的因素進(jìn)行了研究,對(duì)不同Tris-HCl緩沖液pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、不同丙酮比例進(jìn)行初步探討。結(jié)果顯示,在25 ℃下丙酮比例1∶2,Tris-HCl緩沖液pH=8.2,反應(yīng)時(shí)間20 min為最佳反應(yīng)條件。隋英忠[9]研究分析復(fù)方樹莓提取液中過氧化物歧化酶活力,驗(yàn)證其在生物體內(nèi)的抗氧化作用,為深入開發(fā)利用樹莓資源提供依據(jù)。黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基,形成亞硝酸鹽,通過公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD活力,研究結(jié)果表明復(fù)方樹莓提取液在生物體內(nèi)具有一定的抗氧化作用。
目前,SOD的研究大多停留在金屬離子對(duì)SOD活性影響上,對(duì)其機(jī)理的研究多以金屬離子的摻入模式為主,而硒對(duì)植物種子生長(zhǎng)的影響較少。本研究以綠豆為材料施以Na2SeO3浸泡及萌發(fā)處理不同時(shí)間,探索Na2SeO3對(duì)綠豆SOD的影響,以及Se、總SOD、CuZn-SOD活力之間的關(guān)系,為功能性富硒綠豆制品的研制奠定基礎(chǔ)。
市售綠豆,選顆粒飽滿,無蟲蛀者。
超氧化物歧化酶測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)、亞硒酸鈉(先導(dǎo)稀有金屬化工有限公司,分析純)、乙二胺四乙酸(EDTA,天津市福晨化學(xué)試劑廠,分析純)、硒粉(天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心,分析純)、鹽酸羥胺(天津市大茂化學(xué)試劑廠,分析純)、甲酚紅(天津市大茂化學(xué)試劑廠,優(yōu)級(jí)純)及聚乙烯吡咯烷酮K30(上海伯奧生物科技有限公司)。
熒光分光光度計(jì)(上?,F(xiàn)科儀器有限公司,F(xiàn)950)、快速混勻器(蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司,SK-1)、旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司,XW-80A)、分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠,721-100)。
0.2 mol·L-1EDTA:稱7.4 g EDTA二鈉鹽,蒸餾水加熱溶解,冷卻后用蒸餾水稀釋至100 mL;混合酸:硝酸∶過氯酸=2∶1;DAN:0.1% 2,3-二氨基萘(純度95%~98%)需在暗室配制,稱取200 mg DAN于一帶蓋三角瓶中,加入200 mL 0.1 mol·L-1鹽酸,振搖約15 min,使其全部溶解;約加40 mL環(huán)己烷,繼續(xù)振搖5 min,將此液轉(zhuǎn)入塞有玻璃棉(或脫脂棉)分液漏斗中,待溶液分層后,棄去環(huán)己烷層,收集DAN層溶液。
硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 μg·mL-1):精確稱取100.0 mg元素硒(分析純),溶于少量硝酸中,加2 mL過氯酸(70%~72%),置沸水浴中加熱3~4 h,冷卻后加入8.4 mL濃鹽酸,再置沸水浴中煮2 min。準(zhǔn)確稀釋至 1 000 mL,此儲(chǔ)備液硒含量為 100 μg·mL-1。
硒標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.05 μg·mL-1):將硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用 0.1 mol·L-1鹽酸稀釋,使含硒為 0.05 μg·mL-1。于冰箱中保存。
1.4.1 Na2SeO3溶液浸泡對(duì)綠豆SOD活性的影響
根據(jù)富硒綠豆方法,在35 ℃溫度下用濃度為30 μg·mL-1、3 倍于綠豆重量的 Na2SeO3水溶液分別處理綠豆1 h、2 h、3 h、4 h和5 h,測(cè)定總SOD活性、CuZn-SOD活性和蛋白含量以及總硒含量和無機(jī)硒含量[10]。
1.4.2 蒸餾水浸泡對(duì)綠豆SOD活性的影響
35 ℃溫度下用3倍于綠豆重量的蒸餾水分別處理綠豆1 h、2 h、3 h、4 h和5 h,測(cè)定總SOD活性、CuZn-SOD活性和蛋白含量以及總硒含量和無機(jī)硒含量,作為對(duì)照。
1.4.3 富硒綠豆萌發(fā)后SOD活性的變化
在 35 ℃下、用 3.0 μg·mL-1、3倍于綠豆重量的Na2SeO3水溶液處理5 h,洗凈、去除表面水分后繼續(xù)萌發(fā)2 h、4 h、6 h,測(cè)定總SOD活性、CuZn-SOD活性和蛋白含量以及總硒含量和無機(jī)硒含量。
1.4.4 正常生長(zhǎng)的綠豆萌發(fā)后SOD的變化
在35 ℃下、用3倍于綠豆重量的蒸餾水處理5 h,洗凈、去除表面水分后繼續(xù)萌發(fā)2 h、4 h、6 h,測(cè)定總SOD活性、CuZn-SOD活性和蛋白含量以及總硒含量和無機(jī)硒含量,作為對(duì)照。
1.5.1 總SOD的提取
取處理好的樣品1.00 g于研缽中,加入pH=7.8的磷酸緩沖溶液9 mL,充分研磨,即制成10%的組織勻漿,將勻漿倒入離心管中,4 000 r·min-1離心15 min,所得上清液為SOD粗酶液。
1.5.2 總SOD活性的測(cè)定
將SOD粗酶液用生理鹽水稀釋10倍,依表1加入試劑,混勻,室溫放置10 min,與波長(zhǎng)550 nm處,1 cm光徑比色杯,蒸餾水調(diào)零,比色??係OD活力(U·mg-1)按式(1)計(jì)算。
表1 SOD測(cè)定操作表
(1)CuZn-SOD的提取。依照南京建成生物工程研究所研制的SDS+KCl抑制法測(cè)CuZn-SOD,粗酶液提取同總SOD的提取。
(2)CuZn-SOD的測(cè)定。測(cè)定步驟同總SOD測(cè)定。
(3)CuZn-SOD活性的計(jì)算。計(jì)算方法同總SOD。
1.7.1 樣品的處理
將樣品用蒸餾水洗凈,放入100 ℃烘箱中5 h,粉碎后4 ℃保存。
1.7.2 樣品的消化
稱取1.000 0 g樣品于磨口三角瓶?jī)?nèi),加10 mL 5%硫酸,樣品濕潤(rùn)后,再加20 mL混合酸液放置過夜。次日于沙浴上逐漸加熱至淡黃色。
測(cè)定無機(jī)硒及有機(jī)硒含量時(shí),稱取1.000 0 g樣品,加入用 4 mol·L-1HCl 30 mL后,170 ℃加熱、回流20 min,冷卻后用定量濾紙過濾雜質(zhì)。
1.7.3 樣品總硒含量的測(cè)定
將樣品消化液定容到100 mL容量瓶中,吸取10 mL于三角瓶中,加40 mL EDTA混合液,用氨水或鹽酸調(diào)至淡紅橙色(pH=1.5~2.0)。以下步驟在暗室進(jìn)行:加6 mL DAN試劑,混勻,置沸水浴中煮7 min,取出后立即冷卻,加6 mL環(huán)己烷,振搖4 min,將全部溶液移入分液漏斗,待分層后棄去水層,環(huán)己烷層轉(zhuǎn)入裝有約1 g無水硫酸鈉的帶蓋試管中,于波長(zhǎng)360 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定苤硒腦的熒光強(qiáng)度。
1.7.4 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
準(zhǔn)確吸取硒標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.05 μg·mL-1)0 mL、0.4 mL、2.0 mL、4.0 mL及8.0 mL,相當(dāng)于0.00 μg、0.02 μg、0.10 μg、0.20 μg、0.40 μg 硒,加水至 5 mL,按樣品測(cè)定步驟同時(shí)進(jìn)行。
本研究采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定樣品的硒含量,因此,硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及其線性相關(guān)性對(duì)于測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)顯示,硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=125.34X+1.851 4,在0~0.4 μg范圍,樣品熒光強(qiáng)度與其硒含量之間具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9。
圖1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
由圖2可以看出,外源Se對(duì)綠豆中Se含量有顯著影響。隨著浸泡時(shí)間的增加,綠豆中總硒含量逐漸增加。從第3 h開始,綠豆中總硒含量明顯上升,當(dāng)浸泡時(shí)間為5 h時(shí),綠豆中Se含量達(dá)到12.20 μg·g-1,是對(duì)照0.70 μg·g-1的17倍,到了萌芽階段,有機(jī)硒占總硒的90%以上。
圖2 浸泡和萌芽過程中綠豆Se含量的變化圖
由圖3可見,隨著浸泡時(shí)間的增加,SOD的活性逐漸升高,但當(dāng)浸泡時(shí)間達(dá)到3 h后,SOD的活性呈下降趨勢(shì),綠豆中SOD的活性從279.785 U·mg-1降到129.621 U·mg-1,減少了53.7%。隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng),內(nèi)源硒含量增加,SOD活性增加,過量的硒抑制了綠豆SOD的合成。
圖3 浸泡和萌芽過程中總SOD活性的變化圖
由4的結(jié)果可以看出,在綠豆富硒的過程中,CuZn-SOD活性的變化趨勢(shì)與總SOD的變化趨勢(shì)大致相同,都是隨著浸泡時(shí)間的增加,CuZn-SOD的活性逐漸升高,但當(dāng)浸泡時(shí)間達(dá)到3 h后,CuZn-SOD的活性呈下降趨勢(shì)。
圖4 浸泡和萌芽過程中CuZn-SOD活性的變化圖
由圖5可知,CuZn-SOD活性均占總SOD活性60%以上,表明綠豆中SOD主要以CuZn-SOD為主。Na2SeO3浸泡后SOD活性上升,CuZn-SOD活性占總SOD活性比率下降,而在SOD活性下降階段,CuZn-SOD活性占總SOD活性比率上升,說明加硒處理對(duì)SOD活性增長(zhǎng)和抑制作用主要表現(xiàn)在對(duì)Mn-SOD、Fe-SOD活性的作用。
圖5 浸泡和萌芽過程中CuZn-SOD活性占總SOD活性的百分率圖
通過對(duì)綠豆富硒過程中的硒含量、SOD活性的研究,可以看出:①綠豆用Na2SeO3水溶液浸泡3 h,即硒含量為2.13 μg·g-1時(shí)能顯著提高綠豆SOD活性。②綠豆中SOD活性以CuZn-SOD為主,最高是達(dá)到總SOD的97.8%,最低時(shí)占69.1%。但硒處理對(duì)Mn-SOD、Fe-SOD活性無論是增長(zhǎng)作用還是抑制作用,都比CuZn-SOD明顯。③含量過高的無機(jī)硒對(duì)SOD活性的抑制作用強(qiáng)于有機(jī)硒。SOD作為植物體內(nèi)普遍存在的一種專一清除生物氧化中產(chǎn)生超氧陰離子自由基的酶,誘導(dǎo)植物產(chǎn)生更多的SOD,可以用來分離純化,用于食品、藥物、化妝品等領(lǐng)域,仍然是今后的研究課題。