◎ 王曉軍，劉宗昭，張如意，盧丕超，孟 麗

（1.新疆中信國安葡萄酒業(yè)有限公司，新疆 瑪納斯 832200；2.新疆釀酒葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，新疆 瑪納斯 832200）

白藜蘆醇（Resveratrol），又稱芪三酚、3，4，5-三羥基-1，2-二苯乙烯（3，4′，5-Trihydroxystilbene），是一種天然多酚化合物，其存在兩種構象，順式和反式。白藜蘆醇反式異構體比順式結構穩(wěn)定；相對于順式結構，反式白藜蘆醇在自然界中更豐富、更具生物活性[1]。白藜蘆醇存在于各種食品中尤其在紅葡萄中，是一種強有力的抗氧化劑，主要存在于葡萄皮中。紅葡萄酒中普遍含有白藜蘆醇，藥理研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對于炎癥、過敏[2]、血栓、氧化等方面有很好的保健功效[3-4]。

關于葡萄酒中白藜蘆醇的研究很多，但針對瑪納斯產(chǎn)區(qū)葡萄酒中的白藜蘆醇含量測定較少。本文利用高效液相色譜技術對瑪納斯產(chǎn)區(qū)赤霞珠和美樂干紅葡萄酒中的白藜蘆醇測定方法進行了初步摸索，并利用選定的色譜分析條件對瑪納斯產(chǎn)區(qū)不同發(fā)酵溫度下釀造的赤霞珠和美樂干紅葡萄酒中的白藜蘆醇進行測定。

1 材料與方法

1.1 儀器

HPLC系統(tǒng)（色譜柱Shim-pack VP-ODS、紫外檢測器SPD-10Avp、日本島津公司）；超聲波脫氣機（CH-250B 上海躍進醫(yī)療器械廠）；旋轉蒸發(fā)儀（RE-52A 上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 標樣與試劑

白藜蘆醇（色譜純，成都曼斯特生物科技有限公司）；甲醇（色譜純，天津標準科技有限公司）；乙腈（色譜純，天津標準科技有限公司）；磷酸（分析純，天津市永大化學試劑有限公司）；乙酸乙酯（分析純，天津市永大化學試劑有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）。

1.3 酒樣

瑪納斯產(chǎn)區(qū)2020年赤霞珠、美樂品種各自為原料做單品種發(fā)酵，采用相同釀酒輔料，不同的發(fā)酵溫度，其余工藝處理均相同。

1.4 試驗方法

1.4.1 葡萄酒樣品的處理

①直接進樣。②萃取濃縮。取20 mL葡萄酒置于分液漏斗當中，再向其中加入20 mL乙酸乙酯溶液，然后振蕩萃取15 min，再靜置分層后分液，分出有機相之后，使用無水硫酸鈉過濾，重復1次，然后將分出的有機相在50 ℃，真空旋轉蒸發(fā)至近干，用過濾過的色譜甲醇定容至5.0 mL。

1.4.2 標準曲線的制備

稱取2.0 mg白藜蘆醇標準品，配制成濃度為200 mg·L-1的白藜蘆醇10 mL儲備溶液。用白藜蘆醇標準品溶液以甲醇稀釋分別配制成1 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、8 mg·L-1、16 mg·L-1、32 mg·L-1等不同濃度的白藜蘆醇樣品溶液，每一濃度的白藜蘆醇樣品依次取20 μL進樣，按上述確定好的色譜條件測定峰面積積分值，繪制標準曲線并且得到回歸方程。

1.4.3 葡萄酒樣品的測定

酒樣溶液經(jīng)孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾后，按照確定好的色譜條件上樣檢測酒樣中白藜蘆醇的含量。使用9個110 t立式自控溫發(fā)酵罐，對9個發(fā)酵罐中1#、2#、3#樣美樂發(fā)酵溫度分別設定為20 ℃、22 ℃、24 ℃；4#～9#樣赤霞珠發(fā)酵溫度分別設定為20 ℃、22 ℃、22 ℃、24 ℃、24 ℃和30 ℃；經(jīng)酒精發(fā)酵結束封樣檢測結果。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

利用白藜蘆醇標準樣品進樣，觀察比較峰形并對其進行適當調(diào)整。最終，選擇的色譜柱為Shim-pack VP-ODS（4.6 mm×150.0 mm，5 μm)，流動相為乙腈：0.03%磷酸水=24∶76，流速為1 mL·min-1，306 nm為檢測波長，進樣量為20 μL，柱溫30 ℃。

2.2 白藜蘆醇標品圖譜和標準曲線的繪制

將不同梯度濃度的白藜蘆醇對照品溶液分別進樣檢測，記錄峰面積的積分值[5-6]。以白藜蘆醇標準品濃度為自變量x，測得的峰面積為因變量y，作出白藜蘆醇標的線性回歸方程為：y=21 944x-27 805，相關系數(shù)r=0.994 9，表明在所設計的濃度范圍內(nèi)，白藜蘆醇峰面積與其濃度相關性顯著。

2.3 進樣方式的選擇

采用直接進樣和萃取濃縮對葡萄酒樣品溶液檢測，白藜蘆醇標準品的出峰時間為13.262 min，峰形對稱且基線平穩(wěn)；葡萄酒樣品溶液中出峰A和B時間為12.962 min和12.945 min，與白藜蘆醇標準品出峰時間大致相同，因此確定其為白藜蘆醇。

對1#、2#、3#美樂樣品采用直接進樣和萃取濃縮方式進樣，圖1結果顯示，對酒樣萃取濃縮后再進樣檢測，其檢出的白藜蘆醇含量略有降低，檢測值分別降低了16.25%、8.05%和0.5%。說明在處理酒樣的過程中，白藜蘆醇因氧化或萃取不完全而造成了一定的損失[7-8]。結果顯示，樣品中白藜蘆醇在萃取濃縮處理過程中損失較大，不適宜作為紅葡萄酒中白藜蘆醇測定時的預處理的方法。雖然直接進樣法色素等雜質含量較多，易對色譜柱造成污染，使后續(xù)清洗柱子時間延長。但樣品制備簡單，后續(xù)實驗為避免白藜蘆醇在樣品處理過程中因氧化對測定結果造成影響，后續(xù)檢測都采用直接進樣法檢測。

圖1 不同酒樣處理方法測得白藜蘆醇的含量圖

2.4 酒樣測定結果

適當提高發(fā)酵溫度對赤霞珠、美樂干紅葡萄酒中白藜蘆醇溶出量的提升影響顯著[9]。由表1可知在24 ℃比20 ℃下發(fā)酵的美樂干紅白藜蘆醇含量高26.87%。由表2可知在30 ℃下比20 ℃下發(fā)酵的赤霞珠干紅白藜蘆醇的含量高239.5%，相同發(fā)酵溫度下，控溫22 ℃以上發(fā)酵，赤霞珠比美樂品種發(fā)酵過程中溶出白藜蘆醇含量高。

表1 不同發(fā)酵溫度美樂酒樣測定結果表

表2 不同發(fā)酵溫度赤霞珠酒樣測定結果表

3 討論與結論

（1）適當提高發(fā)酵溫度對提升赤霞珠、美樂干紅葡萄酒中白藜蘆醇的溶出量影響明顯。不同發(fā)酵溫度酒樣中白藜蘆醇含量測定結果顯示，不論是赤霞珠還是美樂品種，白藜蘆醇的溶出量都隨著發(fā)酵溫度的升高而提高，30 ℃比20 ℃下發(fā)酵的赤霞珠干紅白藜蘆醇含量高239.5%。24 ℃比20 ℃下發(fā)酵的美樂干紅白藜蘆醇含量高26.87%。造成這種結果的原因是葡萄果實中白藜蘆醇的溶出量隨著發(fā)酵溫度和酒精度的升高而增加。另外，在較高溫度下，所有酚類物質的浸提速度都會增加。雖然升高溫度會有利于白藜蘆醇溶出量的增加，但也不是無限升高溫度白藜蘆醇含量會持續(xù)增加。升高溫度會引起雜菌的滋生和熱敏性物質的破壞與損失，而且會導致香氣成分的遺失，酵母的高溫死亡發(fā)酵停止[10-11]，因此實際生產(chǎn)過程中，也不能一味地提高釀酒溫度。高溫會有過多酚類物質的浸提，香氣成分遺失，釀酒師應在實際生產(chǎn)中根據(jù)生產(chǎn)成本，結合葡萄酒感官指標要求以及產(chǎn)品風格予以合理控制，以獲得風味優(yōu)良且白藜蘆醇含量較高的紅葡萄酒產(chǎn)品。

（2）瑪納斯產(chǎn)區(qū)赤霞珠比美樂品種釀出的葡萄酒中白藜蘆醇含量高。表1和表2的檢出結果看，隨著發(fā)酵溫度設定的提高，相同發(fā)酵溫度下，瑪納斯產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄品種釀出的葡萄酒中白藜蘆醇含量高于美樂干紅葡萄酒。

（3）葡萄產(chǎn)地的氣候條件和土壤環(huán)境，直接影響著葡萄酒中白藜蘆醇含量。我國的西部地區(qū)光照時長、充足，有利于葡萄的生長發(fā)育，漿果顏色深，成熟度好；晝夜溫差大，有利于葡萄的糖分積累，含糖量高；冬季寒冷，葡萄病害不易隔代傳播。而這些因素導致西北地區(qū)較高與東部產(chǎn)區(qū)葡萄白藜蘆醇含量[12]。然而，本次研究當年春季葡萄萌芽期遭受了霜凍，葡萄的成熟度相對較差，檢測白藜蘆醇的含量數(shù)據(jù)較低。從表2結果中看，6#、8#酒樣葡萄園土質情況為黏土層且土層較厚，5#、7#酒樣葡萄園土質情況為沙土礫石且土層較薄。相同發(fā)酵溫度下，22℃時6#酒樣比5#酒樣中檢測出的白藜蘆醇含量低2.6%，24℃時8#酒樣較7#酒樣檢測出的白藜蘆醇含低9.6%，上述情況說明葡萄產(chǎn)地的氣候條件和土壤環(huán)境，直接影響著葡萄酒中白藜蘆醇含量[13-14]。