袁詩涵,Robert W. Li,劉 芳,楊 魯,薛長湖,唐慶娟,*

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003; 2.美國農(nóng)業(yè)部動物基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室,馬里蘭州貝爾茨維爾 MD 20705)

隨著居民生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改變,日常飲食中高脂肪含量食物逐漸增多。長期攝入高脂飲食會擾亂機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài),進(jìn)而引發(fā)多種慢性疾病[1]。肥胖的患病率在幾乎所有年齡段和社會經(jīng)濟(jì)群體中都急劇增加,根據(jù)1975～2014年之間的統(tǒng)計數(shù)據(jù)預(yù)測,到2025年,全球肥胖癥的患病率在男性中將達(dá)到18%,女性中則超過21%[2]。飲食誘導(dǎo)型肥胖帶來的健康問題亟需解決,然而藥物治療容易誘發(fā)體內(nèi)代謝紊亂等副作用,開發(fā)活性物質(zhì)作為功能因子的保健食品,實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)營養(yǎng),已成為當(dāng)前降脂減肥研究的新熱點(diǎn)。

研究表明,高脂飲食誘導(dǎo)腸道功能紊亂,降低腸屏障完整性,改變機(jī)體腸道菌群的結(jié)構(gòu)[3-4]。腸道菌群的紊亂與疾病的發(fā)生密切相關(guān),有研究指出腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡與高血壓、肥胖癥、II型糖尿病、肝硬化等疾病有關(guān)[5-6]。腸道菌群通過維持動態(tài)平衡促進(jìn)機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài),而高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖狀態(tài)會導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào),甚至使宿主對疾病更易感。食品和營養(yǎng)對人類健康具有重要意義,食品的營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)對機(jī)體生理機(jī)能的調(diào)節(jié)作用已成為當(dāng)前研究的一大熱點(diǎn)問題[7-8]。宿主可以通過改變飲食模式改善腸道菌群的結(jié)構(gòu)與功能,從而影響宿主本身的健康[9]。

蝦青素(Astaxanthin,AST)是一種脂溶性的橙紅色類胡蘿卜素,雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)源蝦青素由于其強(qiáng)大的抗氧化能力在降血糖、降血脂、提高免疫力等方面具有巨大潛能和開發(fā)前景[10-12]。本課題組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AST的生物可接收率較低,在肥胖小鼠體內(nèi)未達(dá)到5%,大部分AST隨糞便排出體外,提示AST可以與腸道菌群相互作用(數(shù)據(jù)未顯示)。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)黃單胞菌衍生的AST會影響高脂飲食誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂,可以降低厚壁菌門/擬桿菌門(Firmicutes/Bacteroides)的比例,調(diào)節(jié)腸道菌群的組成,防止高脂飲食引起的肥胖。Liu等[14]的研究表明AST可以調(diào)節(jié)酒精性脂肪肝病模型小鼠的腸道菌群組成,增加疣微菌門(Verrucomicrobia)和Akkermansia的豐度,并且顯著緩解炎癥,減少脂質(zhì)蓄積和肝損傷。AST含有多個共軛雙鍵,是具有四萜類結(jié)構(gòu)的強(qiáng)疏水性化合物[15]。為了改善AST在胃腸道中的釋放和溶解度較低的弊端,多通過脂溶劑、脂乳劑和脂質(zhì)體等運(yùn)載體系提高其生物利用度[15]。脂乳劑是通過外力作用,將蝦青素分散在水相或油相中形成的穩(wěn)定分散體系,探究蝦青素脂乳劑的生理活性將有助于促進(jìn)蝦青素在預(yù)防,管理和治療各種疾病中的更多潛在應(yīng)用[16]。但是迄今為止,蝦青素脂乳劑對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用尚未見報道。因此,本研究運(yùn)用高通量測序技術(shù),通過與AST作對比,探究蝦青素脂乳劑(ASTE)對飲食誘導(dǎo)的菌群結(jié)構(gòu)及功能紊亂的調(diào)節(jié)作用,從而為開發(fā)以ASTE作為功能因子的新產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ),促進(jìn)雨生紅球藻源蝦青素的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C57/BL6J雄性小鼠 SPF級4～6周齡,18～22 g,動物許可證號:SCXK(京)2016-0011,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司;雨生紅球藻油(產(chǎn)品批號:20171102Y)、蝦青素(AST,10%,w/w) 云南愛爾發(fā)生物技術(shù)股份有限公司;大豆油 金龍魚有限公司;QIAamp DNA快速提取試劑盒 德國QIAgen公司;AccuPrimeTaqDNA聚合酶 美國Invitrogen公司;AgencourtAMPure XP bead kit 美國Beckman Coulter Genomics公司;MAIlluminaTruSeq DNA sample prep kit、BioAnalyzer high-sensitivity DNA chip kit、Illumina MiSeq試劑盒 美國Agilent公司。

Nanodrop2000/2000C分光光度計 美國Thermo Scientific公司;Real time PCR儀 美國Biorad公司;BioAnalyzer2100 美國Agilent公司;Illumina測序平臺 美國Illumina公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蝦青素脂乳劑的制備 將適量藻油溶解在大豆油中得到5.25 mg/mL的蝦青素灌胃溶劑。制備蝦青素脂乳劑(ASTE)時,參照先前[17-18]報道的方法并稍加更改。將吐溫80(1%,w/w,GB 2760-2014)溶解在去離子水中以產(chǎn)生水相,然后在磁力攪拌下將油相(溶解在大豆油中的藻油)逐漸添加至水相中使二者比例為1∶1 (w/w)。使用手持式高速剪切均質(zhì)機(jī)在冰浴條件下以8000 r/min充分混合3 min,完成油相和水相的均質(zhì),使蝦青素含量為10%。為了保證脂乳劑穩(wěn)定性,每次灌胃時現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 動物分組及肥胖模型的建立 經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,將32只SPF級4～6周齡(18～22 g)的C57/BL6J雄性小鼠按照體重隨機(jī)分為4組(n=8):正常組(N)、模型組(M)、蝦青素組(MA)和蝦青素脂乳劑組(MAL)。將每只小鼠分別在12 h的明-暗周期下飼養(yǎng),環(huán)境條件控制在(24±2) ℃、相對濕度保持在65%±5%。除正常組(N)喂10%低脂飼料外,其余三組均喂45%高脂飼料。實(shí)驗(yàn)過程中所有小鼠自由進(jìn)食飼料和飲用水。建立高脂肥胖模型56 d,在第57 d開始進(jìn)行受試物處理,持續(xù)28 d。其中,正常組(N)和模型組(M)每天灌胃5 mL/(kg·bw)的生理鹽水;蝦青素組(MA)每天灌胃30 mg/(kg·bw)的AST;蝦青素脂乳劑組(MAL)每天灌胃30 mg/(kg·bw)的ASTE[19]。

1.2.3 動物處死及取材 灌胃受試物28 d后,所有小鼠禁食12 h,采用眼球取血并脫頸椎處死。打開腹腔,迅速取出小鼠結(jié)腸內(nèi)容物置于滅酶離心管中,保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 糞便菌群DNA的提取 提取腸道菌群的DNA時,準(zhǔn)確稱量約0.1 g小鼠糞便,使用QIAamp快速糞便DNA提取試劑盒按照說明書提取糞便菌群總DNA。利用Nanodrop 2000分光光度計檢測所提取DNA樣品的濃度和純度(A260/A280和A260/A230),用BioAnalyzer2100檢測DNA完整性。

1.2.5 DNA擴(kuò)增、文庫構(gòu)建與測序 所提糞便菌群總DNA樣品利用16S rDNA PCR引物(表1)進(jìn)行V3～V4高變區(qū)擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為:DNA樣品,2 ng;TaqDNA聚合酶,2.5 U;MgSO4,200 nm;牛血清蛋白,100 ng/μL;雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。

擴(kuò)增程序設(shè)置為:95 ℃,2 min;95 ℃,30 s;60 ℃,30 s;72 ℃,6 s;20個循環(huán)。用核酸純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物,純化產(chǎn)物使用TruSeq DNA建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,并用BioAnalyzer高靈敏DNA檢測試劑盒定量,之后在Illumina Miseq測序平臺測序,所得數(shù)據(jù)以FASTQ格式保存。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 在Galaxy在線平臺上首先進(jìn)行FASTQ Quality Control檢測,使用FastQC查看原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量,包括測序的長度、GC的含量等,使用Trimmomatic除去接頭序列和Illunina分析中的特定序列。然后使用Trim sequences除去不確定堿基(N),FLASH合并長度短于讀取長度兩倍的DNA片段,FASTQ Groomer將fastq文件轉(zhuǎn)換為FASTA格式用于后續(xù)分析。

1.3.2 物種豐富度計算與注釋 使用QIIME1和QIIME2進(jìn)行OTU聚類分析,將與Greengene數(shù)據(jù)庫相似度大于97%的序列歸為一個OTU,獲得OTU表格。挑選代表性序列,分別與Greengene數(shù)據(jù)庫中的分類學(xué)信息進(jìn)行比對,獲得物種注釋信息。對OTU豐富度進(jìn)行排序和均一化處理,獲得不同分類水平上的物種豐富度圖表。

1.3.3 物種組成與差異分析 使用Calypso(http://cgenome.net/calypso/)進(jìn)行α-多樣性、β-多樣性、物種組成以及差異分析,以P<0.05表示差異在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性。

1.3.4 功能通路預(yù)測分析 通過PICRUSt根據(jù)Greengene數(shù)據(jù)庫預(yù)測不同組別中小鼠結(jié)腸內(nèi)容物腸道菌群的功能。首先按照拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化測序所得的OTU表,預(yù)測宏基因組后按照功能級別進(jìn)行分類匯總,獲得宏基因組功能分類(KO)表以及KEGG功能通路。使用Calypso分析KEGG通路的組間顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)的可靠性評價

稀釋型曲線的斜率指示序列數(shù)據(jù)是否很好地代表了潛在的微生物群落。如果曲線向右變平,則表明已獲得合理數(shù)量的序列讀數(shù),并且更密集的采樣可能只會產(chǎn)生很少的其他物種[20-22]。如圖1顯示,Rarefaction analysis OTU(稀釋型曲線)和Shannon指數(shù)曲線逐漸趨于平坦,證明該研究中所測得的各個樣本的測序數(shù)據(jù)量合理,可以進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖1 宏基因組測序可靠性分析Fig.1 Reliability analysis of the genome sequencing注:A:稀釋型曲線;B:Shannon指數(shù)。 N:正常組,M:模型組,MA:蝦青素組, MAL:蝦青素脂乳劑組,圖2～圖7同。

2.2 ASTE對小鼠腸道菌群多樣性的影響

本研究中選擇了Shannon指數(shù)和均勻度來說明樣本量的差異。如圖2所示,與正常組小鼠相比,高脂飲食導(dǎo)致模型組小鼠腸道菌群的α-多樣性顯著下降8.00%(P<0.05),AST和ASTE均可以改善高脂飲食導(dǎo)致的菌群多樣性減少,Shannon指數(shù)(圖2A)和均勻度(圖2B)結(jié)果均顯示攝食ASTE后,小鼠菌群α-多樣性顯著上升,更接近正常組小鼠。這與之前研究中指出的高脂飲食和肥胖導(dǎo)致菌群α-多樣性下降[7],蝦青素影響腸道菌群多樣性結(jié)果一致[23]。

圖2 蝦青素脂乳劑對高脂飲食 小鼠腸道菌群α-多樣性的影響(n=8)Fig.2 Effect of ASTE on α-diversity of gut microbiota in high-fat diet mice(n=8)注:A:Shannon指數(shù);B:均勻度。

2.3 ASTE對小鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的影響

為了進(jìn)一步明確ASTE對高脂飲食導(dǎo)致的腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用,對β-多樣性進(jìn)行統(tǒng)計。RDA分析和非度量多維尺度(NMDS)分析是目前判斷腸道菌群β-多樣性的常用方法,能夠反映出各組腸道菌群結(jié)構(gòu)間的差異[24-26]。圖3顯示,高脂飲食小鼠和正常小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)之間存在顯著差異,蝦青素組和蝦青素脂乳劑組之間也有一定差異。尤其是在RDA分析中,攝入蝦青素后的兩組與模型組之間均存在極顯著差異(P<0.001)。由此得出結(jié)論:高脂飲食和ASTE干預(yù)均會對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

圖3 蝦青素脂乳劑對高脂飲食小鼠 腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的影響(n=8)Fig.3 Effect of ASTE on community structure of gut microbiota in high-fat diet mice(n=8)注:A:RDA分析;B:非度量多維尺度分析。

圖4 厚壁菌門/擬桿菌門(A)與豐度前20 OTU水平上的聚類熱圖(B)(n=8)Fig.4 Firmicutes/Bacteroidetes(A)and heatmap at OTU level of top 20(B)(n=8)

如圖4A所示,模型組厚壁菌門/擬桿菌門比值(0.50±0.14),高于正常組小鼠(0.47±0.14),AST與ASTE的攝入均在一定程度上降低了該比值(分別為0.38±0.14和0.44±0.09),與多數(shù)研究結(jié)果一致[7,13],。圖4B為豐度在前20位的OTU水平上的聚類熱圖,進(jìn)一步表明高脂飲食和蝦青素干預(yù)均能改變小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu),ASTE能有效改善Rikenellaceae(OTU1696)等有益菌的豐度。

Venn圖可以直觀的反應(yīng)多個樣本或多組樣本的元素組成方面的異同,也是反映腸道菌群結(jié)構(gòu)差異的重要手段。圖5結(jié)果顯示,本研究共注釋了2369個OTU,使用Veen圖展示了這些OTU在各組間的交叉重疊情況。其中,四組共有的OTU僅占39.64%(939個),各組特有的OTU占31.15%(738個)。不同組別均有其特有的OTU,因此針對特有OTU與機(jī)體代謝功能的相關(guān)性分析具有重要意義。

圖5 四組小鼠腸道菌群OTU水平上的韋恩圖(n=8)Fig.5 Venn diagram at OTU levels of four groups of mice(n=8)

2.4 不同組別小鼠組間差異菌的比較

利用在線菌群分析工具Calypso中的LEfSe對正常組、模型組,蝦青素組以及蝦青素脂乳劑組腸道菌群的組成及豐度進(jìn)行了兩兩比較。

圖6 LEfSe分析不同組小鼠之間的顯著差異菌(LDA score>2)Fig.6 LEfSe analysis of gut microbiota significantly different between different groups(LDA score>2)注:A:正常組與模型組;B:模型組與蝦青素組;C:模型組與蝦青素脂乳劑組;D:蝦青素組與蝦青素脂乳劑組。

高脂飲食共引起27個菌群顯著變化(圖6A),副擬桿菌(Parabacteroides)、普雷沃氏菌(Prevotella)、丁酸弧菌(Butyricimonas)、假長雙歧桿菌(Pseudolongum)的相對豐度顯著增加,有益菌擬桿菌(Bacteroides)、毛螺菌(Lachnospiraceae)的相對豐度顯著降低。其中,副擬桿菌(Parabacteroides)與宿主的糖脂代謝有關(guān),豐度與肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝等疾病狀態(tài)顯著相關(guān),推測其具有調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用[27]。攝食AST引起13個菌群顯著變化(圖6B),理研菌科(Rikenellaceae)S247的相對豐度顯著增加;瘤胃球菌(Ruminococcaceae)、梭狀芽孢桿菌(Clostridiales)、脫硫弧菌科(Desulfovibrionacae)的相對豐度顯著降低。而攝食ASTE引起6個菌群顯著變化,其中梭狀芽孢桿菌(Clostridiales)的相對豐度顯著降低,Gnavus、顫螺旋菌(Oscillospiraceae)、擬桿菌(Bacteroidetes)的相對豐度顯著升高。有研究指出,擬桿菌(Bacteroides)能改善宿主代謝作用,在降脂減肥中具有重要作用[28]。梭狀芽孢桿菌(Clostridiales)和瘤胃球菌(Ruminococcaceae)豐度與花青素干預(yù)之后的腹部脂肪含量相關(guān)[28]。理研菌科(Rikenellaceae)、顫螺旋菌屬(Oscillospira)是正常體重青少年的菌群標(biāo)志物[29]。

此外,比較了蝦青素脂乳劑組與蝦青素組的菌群組成(圖6D),有9個菌群豐度存在顯著差異。其中AST顯著增加了擬桿菌(Bacteroides),S247的相對豐度,而ASTE顯著增加了瘤胃球菌(Ruminococcaceae)、Peptococcacae、梭狀芽孢桿菌(Clostridiales)的相對豐度。因此,雖然與AST引起的菌群結(jié)構(gòu)的變化不同,但ASTE也可以降低有害菌的豐度,并改善與降脂減肥相關(guān)菌的豐度。

2.5 ASTE對小鼠腸道菌群功能的影響

有研究指出腸道菌群代謝功能的變化,也會對宿主機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的影響[7]。因此,本研究分析了ASTE對小鼠腸道菌群代謝功能的影響,共預(yù)測了328條KEGG通路,利用Rank test檢驗(yàn)進(jìn)行篩選。圖7A顯示,“色氨酸代謝(Tryptophan metabolism)”、“檸檬烯和蒎烯的降解(Limonene and pinene degradation)”通路在模型組中顯著下調(diào)(P<0.05)。色氨酸在代謝過程中與碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪和維生素等各種營養(yǎng)素之間有十分密切的關(guān)系。檸檬烯對脂肪組織表現(xiàn)出親和性,能改善糖脂代謝紊亂[30]。表明高脂飲食影響了色氨酸和檸檬烯代謝,進(jìn)而影響糖脂代謝,導(dǎo)致宿主體脂蓄積。與模型組相比,AST能顯著上調(diào)“胰島素信號通路(Insulinsignalingpathway)”(圖7B),而ASTE顯著上調(diào)“甘油磷脂代謝(Glycerophospholipid metabolism)”通路(圖7C),推測ASTE可能是通過上調(diào)此通路,促進(jìn)脂質(zhì)代謝,有助于改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。

圖7 不同組別小鼠之間差異顯著的 腸道菌群功能(P<0.05)Fig.7 Significant differences of gut microbiota function between different groups(P<0.05)注:A:正常組與模型組;B:模型組與蝦青素組; C:模型組與蝦青素脂乳劑組; *表示P<0.05,**表示P<0.01。

3 結(jié)論

本研究利用宏基因組測序技術(shù)對小鼠腸道菌群進(jìn)行檢測,通過生物信息學(xué)分析軟件,探究了ASTE對高脂飲食誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂的改善作用。結(jié)果顯示:高脂飲食導(dǎo)致小鼠腸道菌群α-多樣性顯著下降,AST和ASTE均可以改善高脂飲食導(dǎo)致的菌群多樣性減少,ASTE效果更為顯著。與模型組相比,AST和ASTE均增加了能夠改善宿主代謝的擬桿菌(Bacteroides)的相對豐度。AST增加了理研菌科(Rikenellaceae)、S247的相對豐度,而ASTE增加了Gnavus、顫螺旋菌(Oscillospiraceae)的豐度,這些菌與調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝,促進(jìn)降脂減肥相關(guān)。另外,預(yù)測的腸道菌群代謝功能結(jié)果顯示,ASTE能夠顯著上調(diào)甘油磷脂代謝通路?？傊?ASTE可以改善高脂飲食誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂,調(diào)節(jié)菌群代謝功能,有助于改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。