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        血清miR-196a-5p和miR-339-5p表達(dá)水平在乳腺癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值

        2021-06-16 03:31:54吳衍高文玉高蘇平李志紅
        中國普通外科雜志 2021年5期
        關(guān)鍵詞:良性乳腺引物

        吳衍,高文玉,高蘇平,李志紅

        (上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院 普通外科,上海 200135)

        乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率位居中國女性惡性腫瘤首位[1]。但乳腺癌往往起病隱匿,早期缺乏特異性表現(xiàn),臨床主要通過乳腺彩超和鉬靶進(jìn)行初步篩查,進(jìn)而借助病理細(xì)胞學(xué)檢查明確診斷,但這些方法往往導(dǎo)致患者錯(cuò)過早期診治的重要時(shí)機(jī)[2]。微小RNA(miRNA)是一種由18~24個(gè)核苷酸組成的非編碼蛋白R(shí)NA小分子[3-4],通過對靶基因的翻譯抑制或切割降解來調(diào)控基因的表達(dá),其與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),并有研究發(fā)現(xiàn)某些miRNA的異常表達(dá)與乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)[5-6]。通過檢測多種miRNA在乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)的相關(guān)研究顯示,miR-196a-5p呈顯著高表達(dá)[7-8],而miR-339-5p表達(dá)顯著下調(diào)[9]。因此,兩者的生物學(xué)功能可能對乳腺癌診斷有著重要臨床意義,本研究聯(lián)合檢測乳腺癌患者血清miR-196a-5p和miR-339-5p表達(dá)水平,觀察其在乳腺癌早期診斷中的臨床價(jià)值。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料

        選擇2016年1月—2017年6月在我院就診的乳腺外科診治的乳腺癌患者107例(乳腺癌組),年齡35~79歲,平均(51.28±9.65)歲;根據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn):I期34例,II期37例,III期21例,IV期15例;病理為浸潤性導(dǎo)管癌72例,黏液腺癌7例,導(dǎo)管內(nèi)癌8例,小葉癌8例,髓樣癌12例。納入標(biāo)準(zhǔn):均被病理確診乳腺癌,女性;術(shù)前無放化療和內(nèi)分泌治療;均接受乳腺癌的手術(shù)治療;所有患者臨床病理資料完整;無其他腫瘤病史。選擇同期在我院診斷為乳腺良性疾病的患者60例(乳腺良性疾病組),年齡35~79歲,平均(52.19±10.58)歲;其中乳腺病33例,乳腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤11例,乳腺不典型增生7例和乳腺纖維瘤9例。選擇同期在我院行健康體檢者35 例(健康對照組),年齡35~79歲,平均(51.76±9.75)歲。所有的患者均知情同意,并簽署知情同意書和經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。3組在年齡等基線資料具有可比性。

        1.2 方法

        1.2.1 血液標(biāo)本留取患者各組入院后和乳腺癌手術(shù)后1 周抽取肘靜脈血10 mL。采用離心機(jī)將血液離心,離心半徑15 cm,離心速度3000r/min,離心15 min,抽取上清液放置在除酶管內(nèi),放置在-70 ℃冰箱中保存。

        1.2.2 qRT-PCR總RNA 抽取:采用受試者血清400 μL,采用TRIzol 試劑盒進(jìn)行提取血清總RNA,反轉(zhuǎn)錄引物有上海化生有限公司合成,miR-196a-5p 上游引物序列:5'-CGCGCGTAGGTAGTTCATGTT-3',下游引物序列:5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3';miR-339-5p 上游引物序列為:5'-GGGTCCCTGTCCTCCCCA-3',下游引物序列5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'。U6 的上游引物為:5'-GAGGCACAGCGGAACG-3',下游引物:5'-CTACCACATAGTCCAGG-3'。miRNA 的檢測:選擇反轉(zhuǎn)錄酶1 μL,RNA5 μL和3 μL 引物,在15 μL 的反應(yīng)體系中,采用美國ABITaqMan PreAmp Master Mix 進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為:在16 ℃ 30 min,42 ℃反應(yīng)30 min 和85 ℃反應(yīng)5 min。取反轉(zhuǎn)錄配制20 μL 反應(yīng)體系,放置在熒光定量儀中進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性為15 min,94 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,70 ℃延伸30 s,連續(xù)40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品檢測3 次,以2-ΔΔCt表示。

        1.2.3 觀察指標(biāo)比較各組血清miR-196a-5p、miR-339-5p 和乳腺癌特異性標(biāo)志物CA15-3 水平,三者診斷乳腺癌的效能,以及血清miR-196a-5p和miR-339-5p 表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,呈正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)進(jìn)行表示,多組獨(dú)立因素的計(jì)量資料采用方差分析,兩組獨(dú)立因素的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。采用Logistic二元回歸分析得出血清mi R-196 a-5p和miR-339-5p聯(lián)合變量,繪制出受試者曲線(ROC)評價(jià)診斷乳腺癌的效能。采用MedCalc軟件計(jì)算截?cái)嘀?。檢驗(yàn)水準(zhǔn),α=0.05。

        2 結(jié)果

        2.1 各組血清miR-196a-5p、miR-339-5p 和CA15-3水平比較

        乳腺癌組血清miR-196a-5p表達(dá)水平明顯高于乳腺良性疾病組和健康對照組(P<0.01),乳腺良性疾病組明顯高于健康對照組(P<0.01);乳腺癌組血清miR-339-5p表達(dá)水平明顯低于乳腺良性疾病組和健康對照組(P<0.01),乳腺良性疾病組明顯低于健康對照組(P<0.01);乳腺癌患者血清CA15-3水平明顯高于乳腺良性疾病組和健康對照組(P<0.01),而乳腺良性疾病組和健康對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

        表1 各組血清miR-196a-5p、miR-339-5p 和CA15-3 水平比較(±s)Table 1 Comparison of the serum levels of miR-196a-5p,miR-339-5p and CA15-3 among groups(±s)

        表1 各組血清miR-196a-5p、miR-339-5p 和CA15-3 水平比較(±s)Table 1 Comparison of the serum levels of miR-196a-5p,miR-339-5p and CA15-3 among groups(±s)

        注:1)與健康對照組比較,P<0.01;2)與乳腺良性疾病組比較,P<0.01Note:1)P<0.01 vs.healthy control group;2)P<0.01 vs.benign breast disease group

        組別miR-196a-5p(2-△△Ct) miR-339-5p(2-△△Ct)CA15-3(kU/L)健康對照組(n=35)1.52±0.763.12±0.9212.96±5.28乳腺良性疾病組(n=60)2.75±1.071)1.49±0.521)14.77±10.20乳腺癌組(n=105)4.84±1.601),2)0.81±0.381),2)25.10±11.251),2)F 119.680291.44134.393 P 0.0000.0000.000

        2.2 血清miR-196a-5p和miR-339-5p表達(dá)水平在診斷乳腺癌的效能

        血清miR-196a-5p和miR-339-5p表達(dá)的診斷乳腺癌的效能明顯優(yōu)于血清CA15-3(Z=2.543,P<0.05;Z=2.190,P<0.05),而血清miR-196a-5p表達(dá)與miR-339-5 p 之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),將miR-196a-5p和miR-339-5p指標(biāo)進(jìn)行二元Logistic回歸得方程y=1.09×xmiR-196a-5p-3.61×xmiR-339-5p+0.66,聯(lián)合檢測(miR-196a-5p+miR-339-5p)的靈敏度為91.6%,特異度為88.3%,其AUC為0.937,明顯高于單個(gè)指標(biāo)表達(dá)(miR-196a-5p:Z=3.044,P<0.01;miR-339-5p,Z=3.020,P<0.01)(表2)(圖1)。

        表2 血清miR-196a-5p、miR-339-5p 和CA15-3 對診斷乳腺癌的診斷效能Table 2 Diagnostic efficiencies of serum miR-196a-5p,miR-339-5p and CA15-3 for breast cancer

        圖1 血清miR-196a-5p、miR-339-5p 和CA15-3 在診斷乳腺癌的靈敏度和特異度Figure 1 The sensitivities and specificities of serum miR-196a-5p,miR-339-5p and CA15-3 in diagnosis of breast cancer

        2.3 乳腺癌患者術(shù)前miR-196a-5p 和miR-339-5p 表達(dá)的關(guān)系與術(shù)后的變化

        乳腺癌患者術(shù)前血清miR-196a-5p表達(dá)與miR-339-5p呈負(fù)相關(guān)(r=-0.764,P<0.01),手術(shù)后乳腺癌患者血清miR-196a-5p和miR-339-5p表達(dá)分為1.86±0.85和2.59±0.86,血清miR-196a-5p表達(dá)水平較手術(shù)前明顯降低(P<0.01),而miR-339-5p表達(dá)較術(shù)前明顯升高(P<0.01)。

        2.4 乳腺癌患者血清miR-196a-5p 和miR-339-5p 表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

        乳腺乳腺癌患者血清miR-196a-5p和miR-339-5p表達(dá)水平與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期具明顯有關(guān)(均P<0.01),而與年齡,絕經(jīng)否,組織學(xué)分級,ER,PR和HER-2無明顯關(guān)系(均P>0.05)(表3)。

        表3 乳腺癌患者血清miR-196a-5p 和miR-339-5p 水平與臨床病理因素的關(guān)系(±s)Table 3 Relations of serum levels of miR-196a-5p and miR-339-5p in breast cancer patients with clinicopathologic factors(±s)

        表3 乳腺癌患者血清miR-196a-5p 和miR-339-5p 水平與臨床病理因素的關(guān)系(±s)Table 3 Relations of serum levels of miR-196a-5p and miR-339-5p in breast cancer patients with clinicopathologic factors(±s)

        因素年齡(歲例數(shù)(n)miR-196a-5ptPmiR-339-5ptP)<50674.84±1.630.0530.9580.81±0.380.0950.924≥50404.83±1.570.82±0.37絕經(jīng)與否是454.83±1.560.0610.9510.82±0.360.0270.979否624.84±1.640.81±0.39腫瘤直徑(cm)>2576.01±1.0513.1360.0000.53±0.2014.8150.000≤2503.49±0.911.14±0.23組織學(xué)分級I295.02±1.490.77±0.35II374.66±1.740.4260.6540.85±0.410.3910.678III414.86±1.570.81±0.37

        表3 乳腺癌患者血清miR-196a-5p 和miR-339-5p 水平與臨床病理因素的關(guān)系(±s)(續(xù))Table 3 Relations of serum levels of miR-196a-5p and miR-339-5p in breast cancer patients with clinicopathologic factors(±s)(continued)

        表3 乳腺癌患者血清miR-196a-5p 和miR-339-5p 水平與臨床病理因素的關(guān)系(±s)(續(xù))Table 3 Relations of serum levels of miR-196a-5p and miR-339-5p in breast cancer patients with clinicopathologic factors(±s)(continued)

        因素巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)(n)miR-196a-5ptPmiR-339-5ptP淋有553.54±0.9213.3340.0000.51±0.2014.7190.000無526.07±1.041.13±0.23TNM 分期I343.12±0.881.25±0.19II374.69±0.43106.7420.0000.81±0.10268.5730.000III~I(xiàn)V366.61±0.870.40±0.16ER陽性644.85±1.650.0690.9450.81±0.380.1260.900陰性434.82±1.520.82±0.37PR陽性664.82±1.630.1410.8880.82±0.380.9620.911陰性414.86±1.570.81±0.37HER-2陽性324.98±1.430.6200.5370.78±0.330.6500.517陰性754.77±1.680.83±0.39

        3 討論

        miRNA是一類進(jìn)化上保守的小分子非編碼RNA,成熟miRNA通過與mRNA的3'非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合誘導(dǎo)其降解、翻譯抑制或從翻譯機(jī)制中截留靶向mRNA來調(diào)控基因的表達(dá)[10]。研究[11-12]表明,特定的miRNA在不同的腫瘤中出現(xiàn)明顯的上調(diào)或下調(diào),可能作為腫瘤預(yù)測標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn),具有顯著的臨床價(jià)值。miRNA表達(dá)具有組織特異性,其表達(dá)差異可以區(qū)分不同分化類型的腫瘤,也可以區(qū)分正常組織和腫瘤組織,臨床診斷中可以幫助尋找腫瘤原發(fā)病灶[13-14]?,F(xiàn)在其已作為某些特定腫瘤的分子診斷學(xué)依據(jù),而且其在腫瘤治療和預(yù)后中的作用也受到極大的關(guān)注[15-16]。

        miR-196a是2004年發(fā)現(xiàn)的HOX家族基因轉(zhuǎn)錄而來,在細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)過程中扮演著重要角色,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在重要聯(lián)系?,F(xiàn)有研究顯示miR-196a在多種腫瘤表現(xiàn)出類似致癌基因的生物學(xué)特性,且降低miR-196a的表達(dá)具有明顯抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移侵襲、促進(jìn)凋亡甚至有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用[12,17]。王艷等[9]研究通過miRNA芯片技術(shù)檢測847種miRNA在不同侵襲力乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá),獲得與乳腺癌侵襲相關(guān)的miRNA表達(dá)譜,miR-339-5p表達(dá)顯著改變,具有類似抑癌基因的生物學(xué)特性,并發(fā)現(xiàn)miR-339-5p轉(zhuǎn)染到乳腺癌中能夠明顯抑制乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[18],兩者可能成為乳腺癌診斷的重要腫瘤預(yù)測標(biāo)志物。

        在一項(xiàng)食管癌的研究證實(shí)miR-196a出現(xiàn)高表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)miR-196a能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移,對與預(yù)測腫瘤預(yù)后和早期診斷方面具有較高的臨床價(jià)值[19]。在對胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)miR-196a高表達(dá),并且與腫瘤大小和腫瘤分期呈正相關(guān),與患者的生存期呈負(fù)相關(guān)[20-21]。miR-196a在結(jié)腸癌組織或者細(xì)胞系中呈高表達(dá),而高表達(dá)的miR-196a可以激活A(yù)kt信號通路促進(jìn)結(jié)腸癌的侵襲和遷移能力,并且增強(qiáng)細(xì)胞對化療藥物的耐藥[22]。本組研究顯示乳腺癌組患者血清miR-196a-5p表達(dá)水平明顯優(yōu)于乳腺良性疾病組和健康對照組,并且術(shù)后血清miR-196a-5p水平出現(xiàn)明顯降低,說明血清miR-196a-5p表達(dá)來源于乳腺癌細(xì)胞。miR-196a-5p在乳腺癌的表達(dá)水平研究較少,有研究發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)染miR-196a-2到乳腺癌細(xì)胞內(nèi),會(huì)起到類似致癌基因的作用,并認(rèn)為miR-196a-2可以作為乳腺癌的新型標(biāo)記物[23]。本組研究還發(fā)現(xiàn)血清miR-196a-5p表達(dá)水平腫瘤直徑,分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移具有顯相關(guān)性,并且發(fā)現(xiàn)血清miR-196a-5p表達(dá)量超過3.479(2-ΔΔCt),其診斷乳腺癌的靈敏度為84.1%,特異度80.0%,AUC為0.866具有較高的診斷效能,可能作為診斷乳腺癌的敏感指標(biāo)。

        有研究[24-26]發(fā)現(xiàn)miR-339-5p表達(dá)在胃癌、結(jié)腸癌、肺癌和食管癌等實(shí)體腫瘤中出現(xiàn)明顯的表達(dá)異常。在一項(xiàng)胃癌的細(xì)胞株研究發(fā)現(xiàn)miR-339-5p出現(xiàn)明顯的低表達(dá),高侵襲性的細(xì)胞株表達(dá)更低[27]。且在結(jié)腸癌中得到同樣的結(jié)論[28],將miR-339-5p轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌細(xì)胞中,其侵襲和增殖能力明顯降低,形成腫瘤的能力明顯降低。本組研究顯示乳腺癌組血清miR-339-5p表達(dá)水平明顯低于良性乳腺疾病組和健康對照組,并且發(fā)現(xiàn)乳腺癌術(shù)后血清miR-339-5p表達(dá)水平出現(xiàn)明顯提高,說明乳腺癌與miR-339-5p表達(dá)水平具有一定的聯(lián)系,與Zheng等[29]報(bào)道的結(jié)論接近,將miR-339-5p基因轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在裸鼠體內(nèi)成瘤的時(shí)間明顯延長,充分說明miR-339-5p基因有類似抑癌基因的特性。在對抑制乳腺癌的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)miR-339-5p可以通過抑制BCL-6水平的表達(dá),從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[30]。本組研究還發(fā)現(xiàn)乳腺癌腫瘤分期越高,淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,直徑越大,血清miR-339-5p表達(dá)越低,同時(shí)發(fā)現(xiàn)≤1.32(2-ΔΔCt)時(shí),其靈敏度為94.4%,特異度為65.0%,AUC為0.856,在診斷乳腺癌具有較高的診斷效能,故血清miR-339-5p可能為診斷乳腺癌的診斷指標(biāo)。

        本組研究發(fā)現(xiàn)血清miR-196a-5p表達(dá)水平與miR-339-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān),并且發(fā)現(xiàn)血清miR-196a-5p和miR-339-5p表達(dá)水平在診斷乳腺癌的診斷效能均高于CA15-3,聯(lián)合檢測miR-196a-5p和miR-339-5p能夠明顯提高對乳腺癌的診斷效能,其靈敏度達(dá)到91.6%,特異度為88.3%,AUC明顯高于單個(gè)指標(biāo),說明兩指標(biāo)之間存在某種互補(bǔ)性,故聯(lián)合檢測能夠提高乳腺癌診斷效能,但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。綜上所述,聯(lián)合miR-196a-5p和miR-339-5p基因檢測有助于對乳腺癌的診斷。

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