黃俊，高關(guān)鳳，曾艷，唐海林，楊鳳姣

（1.邵陽學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 邵陽 422000；2.中山大學(xué) 腫瘤防治中心，廣東 廣州 510000）

乳腺癌是全世界婦女最常見的惡性腫瘤之一[1]。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌的一種亞型，不表達(dá)HER-2 受體、雌激素受體（ER）及孕激素受體（PR）。臨床上采取綜合治療方法，對早期TNBC的治療可以起到一定的效果，而對于中期或晚期患者則以化學(xué)療法為主[2]。但晚期患者化療的反應(yīng)期和總體生存期（OS）都較短，且易產(chǎn)生毒性和耐藥性[3-6]。盡管TNBC患者僅占乳腺癌患者的12%～17%[7]，但與其他類型的乳腺癌相比，TNBC是侵襲性和轉(zhuǎn)移性最強的亞型，且由于缺乏有效的治療靶點而被認(rèn)為是預(yù)后最差的亞型[8-9]。毫無疑問，研發(fā)更為有效的分子靶標(biāo)和新型生物標(biāo)志物是完善TNBC治療和監(jiān)測的當(dāng)務(wù)之急。新標(biāo)靶的探索及相關(guān)機制對治療TNBC具有重要意義。

最近，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）對癌癥進展和復(fù)發(fā)的復(fù)雜影響引起了醫(yī)學(xué)界極大的研究興趣[10]。circRNA是一類內(nèi)源單鏈非編碼RNA分子，在人類細(xì)胞中廣泛分布且種類，可以調(diào)節(jié)真核生物中的基因表達(dá)[11]。circRNA作為一種調(diào)控性RNA，可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)選擇性剪接，抑制miRNA的成熟，促進蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用以及充當(dāng)miRNA的海綿[12]。它是一種穩(wěn)定表達(dá)的非編碼RNA，circRNA的失調(diào)在人類癌癥發(fā)病機理中也起著至關(guān)重要的作用[13]。越來越多的報道表明circRNA與多種人類腫瘤相關(guān)，例如乳腺癌[14]，肺癌[15]，肝細(xì)胞癌[16]，膀胱癌[17]，腎細(xì)胞癌[18]和乳腺癌[19]。有研究報道，來自F-box和WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域的circRNA（circFBXW7）通過編碼新型21 kDa蛋白FBXW7-185aa在人腦中的發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用?；騀BXW7部分外顯子來源的circRNA編碼的蛋白可與FBXW7 mRNA編碼的蛋白協(xié)同作用，調(diào)控原癌基因Myc的穩(wěn)定性，從而抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進展[20]。最近，一項研究認(rèn)為circFBXW7可通過競爭性吸附miR-197-3p并編碼FBXW7-185aa蛋白上調(diào)FBXW7基因表達(dá)，從而抑制乳腺癌的進展[21]。然而，circFBXW7在TNBC的作用及機制仍不清楚。本研究旨在探討circFBXW7對TNBC細(xì)胞的增殖、侵襲性的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本與資料

臨床標(biāo)本收集了從2005年3月3日—2011年9月26日于中山大學(xué)腫瘤防治中心被確認(rèn)為TNBC患者的240例新鮮腫瘤樣本，患者的隨訪時間5年以上或者截止到死亡結(jié)局發(fā)生時。所有切除的組織均立即浸入RNAlater（Ambion，TX）中；患者定期隨訪，并記錄臨床數(shù)據(jù)。這項研究經(jīng)中山大學(xué)腫瘤防治中心倫理委員會批準(zhǔn)，并根據(jù)赫爾辛基宣言進行。參與本研究前已獲得所有患者書面知情同意。240例患者的基本臨床資料見表1。

表1 240 例患者的基本臨床資料[n（%）]Table 1 The general data of the 240 patients[n(%)]

1.2 細(xì)胞株及主要試劑

人類TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231、HCC1806購自美國ATCC細(xì)胞庫，經(jīng)過適當(dāng)培養(yǎng)并傳代不超過10代。MDA-MB231和HCC1806細(xì)胞系均無支原體及其他污染物感染。RPMI1640和DMEM（4.5 g）培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，TRIzol購自美國Invitrogen公司，SYBRSuper Mix試劑購自日本Takara，PCR引物購自GeneCopoeia有限公司。CCK-8試劑盒購自日本Dojindo，Transwell小室（孔徑3.0 μm）購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。circFBXW7 shRNA購自GeneCopoeia有限公司。

1.3 qRT-PCR 法檢測circFBXW7 在TNBC 組織中的表達(dá)

乳腺癌組織和細(xì)胞用按照試劑說明書用TRIzol裂解提取總RNA，按照GeneCopoeia反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA，用SYBRPremix Ex Taq進行qRT-PCR。以GAPDH為內(nèi)參。利用各實驗組目的基因及內(nèi)參基因的Ct值，按照公式ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量，所有qRT-PCR分析均使用Bio-Rad IQTM5多色實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)（美國）進行。反應(yīng)體系為20 μL，每個樣本重復(fù)3次。

1.4 載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

載體的合成和轉(zhuǎn)染人circ FBXW7 的全長cDNA，并將其克隆到pCDNA3.0 載體中以構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒，通過q RT-PCR 評估效率，用Lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染，完全培養(yǎng)基中細(xì)胞生長至約50%密度；室溫下孵育20 min，使形成脂質(zhì)體復(fù)合體；往復(fù)合體中加入無血清的培養(yǎng)液，溫和混勻，加入到待轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)瓶中；細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24～48 h后，收集細(xì)胞，抽提總RNA，蛋白。microRNA抑制劑和模擬物由GeneCopoeia公司合成。

1.5 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖

制備單細(xì)胞懸液：取對數(shù)增殖期的MDAMB-231和HCC1806以103細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中，每孔設(shè)置3個復(fù)孔，孵育48 h后。每個孔中加入10 μLCCK-8溶液添加至鋪板的細(xì)胞中，將其在37 ℃，5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)，孵育2 h。使用微量滴定板讀數(shù)器評估450 nm波長的吸光度。

1.6 Transwell 小室檢測細(xì)胞遷移與侵襲能力

通常，使用遷移室進行Transwell分析，收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以2×104個懸浮細(xì)胞重懸于無血清的培養(yǎng)基中，每孔設(shè)置3個復(fù)孔，然后轉(zhuǎn)移到水合基質(zhì)膠室中。并將20%胎牛血清作為趨化劑添加到下室中在37 ℃和5%CO2孵育48 h后，用棉簽刮擦上表面的細(xì)胞，將膜底部的浸潤細(xì)胞在室溫下用甲醇固定30 min，然后在室溫下用結(jié)晶紫染色，計數(shù)并成像。

1.7 克隆形成實驗

消化重懸細(xì)胞至適宜密度，以1×103個細(xì)胞每孔的數(shù)量接種于六孔板中并在溫箱中孵育7～14 d，待肉眼可觀察到細(xì)胞集落形成終止培養(yǎng)。用PBS洗去殘余的培養(yǎng)基后，甲醇固定細(xì)胞集落10 min，倒去甲醇開蓋晾干剩余的甲醇，加入0.1%結(jié)晶紫染色15 min。之后，對集落進行拍照和計數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組之間的比較采用t檢驗和χ2檢驗進行，根據(jù)Kaplan-Meier方法繪制OS和無病生存（DFS）曲線，并使用Log-rank檢驗進行比較，從手術(shù)當(dāng)天起開始計算存活時間。使用Cox回歸分析circFBXW7單因素和多因素與生存的關(guān)系，以及風(fēng)險值（HR）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circFBXW7 表達(dá)與TNBC 患者預(yù)后的關(guān)系

240 例TNBC 患者新鮮癌組織標(biāo)本中circ FBXW7 的平均表達(dá)水平為1.043±0.268。以平均表達(dá)水平定義為臨界值，將患者分為高表達(dá)組（表達(dá)量>1.043）和低表達(dá)組（表達(dá)量≤1.043），其中高表達(dá)組100例，低表達(dá)組140例，低表達(dá)組死亡為28 例，復(fù)發(fā)為30 例；高表達(dá)組死亡10例，復(fù)發(fā)12例。Kaplan-Meier生存分析顯示，低circFBXW7組患者的OS和DFS均明顯短于高circFBXW7組患者（均P<0.05）（圖1）。

圖1 不同circFBXW7 表達(dá)水平TNBC 患者的OS 和DFS 曲線Figure 1 The OS and DFS curves of TNBC patients with different circFBXW7 expression levels

2.2 TNBC 患者預(yù)后因素分析

單因素Cox回歸分析顯示，組織學(xué)分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、circFBXW7表達(dá)是TNBC患者預(yù)后的影響因素（均P<0.05）；多因素Cox回歸分析顯示，組織學(xué)分級、TNM分期、circFBXW7表達(dá)是TNBC患者預(yù)后的獨立影響因素（均P<0.05）（表2）。

表2 單因素和多因素Cox 回歸分析Table 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis

2.3 circFBXW7 對TNBC 細(xì)胞增殖的影響

為了研究circFBXW7在TNBC細(xì)胞中的生物學(xué)功能和作用，構(gòu)建了circFBXW7過表達(dá)載體，并驗證了其在MDA-MB-231和HCC1806細(xì)胞系中的作用，結(jié)果顯示，過表達(dá)組TNBC細(xì)胞株（MDAMB-231、HCC1806）的circFBXW7表達(dá)量明顯高于對照組（均P<0.05）（圖2）。細(xì)胞增殖測定實驗結(jié)果表明，circFBXW7的過表達(dá)的TNBC細(xì)胞系（MDA-MB-231和HCC1806）的增殖能力明顯降低（均P<0.05）（圖3）。

圖2 circFBXW7 在TNBC 細(xì)胞株中過表達(dá)驗證Figure 2 Verification of circFBXW7 over-expression of in TNBC cell lines

圖3 過表達(dá)circFBXW7 對TNBC 細(xì)胞增殖能力的影響Figure 3 Effect of circFBXW7 over-expression on proliferation of TNBC cells

2.4 circFBXW7 對TNBC 細(xì)胞的遷移、侵襲的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，circFBXW7的過表達(dá)明顯抑制了這兩種TNBC細(xì)胞系的遷移能力（均P<0.05）（圖4），加入基質(zhì)膠后檢測過表達(dá)circFBXW7后兩種TNBC細(xì)胞系的侵襲能力（均P<0.05）（圖5）。

圖4 過表達(dá)circFBXW7 對TNBC 細(xì)胞遷移能力的影響Figure 4 Effect of circFBXW7 over-expression on migration ability of TNBC cells

圖5 過表達(dá)circFBXW7 對TNBC 細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 5 Effect of circFBXW7 over-expression on invasion ability of TNBC cells

2.5 過表達(dá)circFBXW7 對miR-197-3p 表達(dá)的影響

q RT-PCR 結(jié)果顯示，過表達(dá)組TNBC 細(xì)胞（MDA-MB-231、HCC1806）中的miR-197-3p表達(dá)量明顯低于對照組（均P<0.05）（圖6）。

圖6 過表達(dá)circFBXW7 對miR-197-3p 表達(dá)的影響Figure 6 Influence of circFBXW7 overexpression on miRNA-197-3p expression

2.6 抑制miR-197-3p 對circFBXW7 敲除所致的細(xì)胞增殖和侵襲能力增強的影響

在敲除circ FBXW7 的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-197-3p抑制劑，再進行Transwell實驗和克隆形成實驗，結(jié)果顯示，抑制miR-197-3 p 后可減少由于circ FBXW7 敲低所致的細(xì)胞增殖和侵襲能力的增強（均P<0.05）（圖7）。該結(jié)果提示，circFBXW7可能是通過miR-197-3p發(fā)揮作用，通過吸附miR-197-3 p，減少其表達(dá)，抑制腫瘤的發(fā)展。

圖7 抑制miR-197-3p 對circFBXW7 敲除所致的細(xì)胞增殖和侵襲能力增強的影響 A：克隆形成實驗檢測增殖能力；B：Transwell 實驗檢測侵襲能力Figure 7 Influences of miR-197-3p inhibition on the increased proliferation and invasion abilities induced by circFBXW7 knockdown A:Colony formation assay for determining proliferation ability;B:Transwell assay for determining invasion ability

3 討論

盡管診斷和治療手段得到了一定的發(fā)展，但是乳腺癌仍然是女性人群癌癥中死亡的主要原因[22]。circRNA是人類癌癥中重要的調(diào)節(jié)因子[23]。隨著下一代測序和生物信息技術(shù)的迅速發(fā)展，人們已經(jīng)闡明了circRNA在人類癌癥中起著至關(guān)重要的作用，并表現(xiàn)出作為生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的巨大潛力[24-26]。circRNA與傳統(tǒng)的線性RNA相比，通過反向剪接產(chǎn)生的共價閉合環(huán)沒有5'-cap或3'-poly（A）尾巴，屬于內(nèi)源性非編碼RNA的新興亞組。其特征是組織特異性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[27-30]。迄今為止，已有不同研究小組篩選和鑒定了多種與癌癥（包括乳腺癌在內(nèi)）相關(guān)的功能性circRNA[31]。這些circRNA在多種癌癥中起癌基因或抑癌作用[32]。據(jù)報道[21,33]circFBXW7具有抑癌作用，在正常腦組織中大量表達(dá)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中下調(diào)[20]。但是，TNBC中circFBXW7的生物學(xué)功能和作用仍然不清楚。本研究探討了circFBXW7在TNBC中的作用機制及臨床價值，使用Kaplan-Meier方法分析了240例TNBC患者的circFBXW7表達(dá)水平來評判OS和DFS。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低circFBXW7水平的乳腺癌患者的OS和DFS較差。且Cox分析結(jié)果顯示，高表達(dá)circFBXW7患者死亡的風(fēng)險明顯升高。這些結(jié)果表明circFBXW7的低表達(dá)與TNBC患者較差的臨床預(yù)后密切相關(guān)。由此可以推斷circFBXW7可能是TNBC患者的獨立預(yù)后因素。

筆者在之前的研究中檢測了TNBC 細(xì)胞系（MDA-MB-231 和HCC1806）中circ FBXW7的表達(dá)水平，其表達(dá)水平較低，通過過表達(dá)circFBXW7后，用CCK8法檢測MDA-MB-231和HCC1806細(xì)胞增殖情況并使用Transwell小室法實驗檢測細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外試驗中，過表達(dá)MDA-MB-231 和HCC1806 細(xì)胞中circFBXW7水平后，顯著抑制了MDA-MB-231和HCC1806細(xì)胞的增殖、侵襲能力，同時，兩種細(xì)胞的miR-197-3p表達(dá)水平也明顯降低。然而，使用miR-197-3p抑制劑后，circFBXW7表達(dá)降低所致的細(xì)胞增殖和侵襲能力增強被明顯抑制。以上結(jié)果提示，circFBXW7可能通過吸附miR-197-3p，減少其表達(dá)，抑制腫瘤的發(fā)展。

總之。本研究表明，circ FBXW7 可以抑制TNBC 的發(fā)生發(fā)展，其作用機制可能與通過miRNA海綿作用吸附miR-197-3p的作用有關(guān)，circFBXW7有望成為TNBC預(yù)后生物標(biāo)志物及潛在治療靶標(biāo)。