侯琛

（天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/天津市“腫瘤防治”重點實驗室/乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津 300060）

乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)生率和病死率[1]。腫瘤轉移是導致乳腺癌患者發(fā)生轉移的主要原因[2]，其中以骨轉移最為常見，嚴重影響患者的生活質量。Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）能夠促進成骨細胞分化與形成[3]，參與調節(jié)細胞外基質（ECM）重塑相關基因轉錄[4-5]，其高表達與乳腺癌骨轉移密切相關[6]?；|金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）作為RUNX2的靶基因，可以降解多種ECM底物[7]，在腫瘤侵襲、轉移中起促進作用[8]。

早期研究發(fā)現RUNX2可調節(jié)MMP家族成員的表達，如MMP-9、MMP-13[9-10]，但有關RUNX2調節(jié)乳腺癌中MMP-3表達的研究非常有限。本研究將進一步探討RUNX2表達水平對MMP-3基因轉錄的影響及其機制，為乳腺癌的靶向治療研究提供潛在的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

乳腺癌細胞MDA-MB-231、BT-549和人胚胎腎上皮細胞293T購于ATCC細胞庫；Opti-MEM、胎牛血清、RPMI-1640以及DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；Lipofectamine 2000、逆轉錄試劑盒以及Platinum Quantitative PCRSuperMix-UDG試劑盒購于美國Invitrogen公司；氨芐青霉素購自上海生工公司；RUNX2、MMP-3抗體購于Santa Cruz公司，β-actin抗體購于美國Abcam公司；T4DNA連接酶、限制性內切酶Hind III酶、Xho I酶、GeneJETPlasmid Miniprep Kit試劑盒和GeneJETGel Extraction試劑盒購于美國Thermo公司；感受態(tài)細胞DH-5α、PrimeSTARMax DNA Polymerase、DNA Marker購自日本TaKaRa公司；Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司；染色質免疫共沉淀試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2 RUNX2 和MMP-3 基因靶向關系以及無遠處轉移生存（DMFS）的生物信息學預測

利用cBioPortal數據庫（http://www.cbioportal.org）根據Breast Cancer（METABRIC,Nature 2012 &Nat Commun 2016）數據集分析1902例乳腺癌患者組織中RUNX2和MMP-3 mRNA水平間相關性；在Kaplan Meier Plotter數據庫（http://kmplot.com/analysis）中下載乳腺癌患者基因表達數據及生存信息，分析基因表達譜與預后間關系（http://kmplot.com/analysis）；生物信息學方法（http://www.cbioportal.org；http://jaspar.genereg.net；http://kmplot.com/analysis）預測乳腺癌中RUNX2與MMP-3的相關性和啟動子區(qū)結合的保守序列以及其在乳腺癌患者中與DMFS的相關性[11]。

1.3 染色質免疫共沉淀（ChIP）

在MDA-MB-231細胞中轉染帶有His標簽的RUNX2過表達質粒，并用His抗體特異性結合于RUNX2結合的基因啟動子序列。收集ChIP-DNA產物并利用GeneJETPCRPurification Kit試劑盒純化。引物設計軟件（NCBI中Primer Blast）設計擴增引物序列（MMP-3 基因啟動子區(qū)），引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應和瓊脂糖凝膠電泳分析RUNX2 對MMP-3啟動子DNA 片段的結合。C h IP 引物上游序列：5'-ATAGGGATCTTATTGC-3'，下游序列：5'-GAACATCTTGGGAGTA-3'；空白對照引物上游序列：5'-GAATGTTTGGAAATGGTCCT-3'，下游序列：5'-TCTCTATGCCTTGCTGTC-3'。PCR反應擴增模板即ChIPDNA。反應體系為：10×Buffer 2.5 μL，dNTP（25 mmol/L）2 μL，其中，上下游引物（10 mmol/L）各0.5 μL，DNA2 μL，Taq酶2.5U，補充水至25 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性4 min；94 ℃ 30 s，最適退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，共37個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后，在成像儀中觀察RUNX2在MMP-3基因啟動子區(qū)序列是否存在結合。

1.4 細胞轉染、qRT-RCR 和Western blot

分別收集轉染了siRUNX2、RUNX2過表達質粒的MB-MDA-231及BT549細胞并提取RNA，使用逆轉錄試劑盒將所提取的RNA反轉為cDNA；隨后，通過qRT-PCR檢測干擾RUNX2處理后的MMP-3的mRNA表達水平。RUNX2的上游引物序列：5'-CTCTGCACCAAGTCCTTTTAATC-3'，下游引物序列：5'-AGGAGGGGTAAGACTGGTCATAG-3'，探針序列：5'-TGCCTGGGGTCTGTAATCTGAC-3'；MMP-3 上游引物序列：5'-TGCCCACTTTGATGATGAG-3'，下游引物序列：5'-GTTGGCTGAGTGAAAGAGACC-3'，探針序列：5'-GACAAAGGATACAACAGG GACCAAT-3'。TaqMan PCR反應體系：10 μLSuperMix，0.4 μLRox，0.6 μL上下游引物，1 μL模板cDNA，加水補至20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性30 s，65 ℃（RUNX2）或57 ℃（MMP-3）延伸30 s，共40 個循環(huán)。以GAPDH為內參，用2-ΔΔCt值表示目的基因的相對表達水平。

分別收集轉染了siRUNX2、RUNX2過表達質粒的MB-MDA-231及BT549細胞，PBS沖洗2次后置于裂解液中冰上裂解30 min，隨后，4 ℃，12000r/min離心15 min，吸取上清于新EP管中進行蛋白質濃度測定。10% SDS-PAGE分離蛋白并轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，按比例稀釋一抗，β-actin（1∶7000）、RUNX2（1∶1000）、MMP-3（1∶1000），4 ℃過夜孵育；TBST 洗膜3 次（7 min/次）后室溫孵育二抗1 h，再用TBST洗膜3次（7 min/次），加入ECL發(fā)光工作液后顯影觀察。

1.5 PCR 法擴增目的DNA 片段及純化

以收取細胞基因組DNA為模板，運用PCR法擴增MMP-3基因包含結合序列以及空白對照的兩個不同片段大小的啟動子區(qū)目的基因。雙熒光引物空白對照上游序列：5'-GGAGGTACCCTATTCTGCCCATGAGGTTT-3'，下游序列：5'-GCAGATCTCTGCCTCCTTGTAGGTCCAA-3'；雙熒光包含RUNX2結合位點的引物上游序列5'-GGAGGTACCGGGCATCTTCAGTCATAGGG-3'下游序列5'-GCAGATCTCTGCCTCCTTGTAGGTCCAA-3'。PCR 的反應條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸15 s，共35 個循環(huán)。PCR 的反應體系：2×PrimeSTARMax Premix 25 μL；DNA2 μL；上、下游引物各 1 μL；加水補至50 μL。

1.6 MMP-3 基因啟動子熒光素酶報告基因質粒的構建

應用特異的限制性內切酶Xho I和Hind III對PGL3-Basic質粒以及合成的啟動子基因片段進行雙酶切反應。反應物37 ℃水浴過夜，瓊脂糖凝膠電泳切取回收目的片段進行DNA純化，同時利用T4DNA連接酶在PGL3-Basic載體中插入DNA片段，并將所得反應物置于4 ℃過夜連接。隨后將10 μL的連接產物加入120 μL感受態(tài)細胞DH5α中，冰上放置30 min后，42 ℃的水浴90 s，再次置于冰上10 min。隨后，復加（無氨芐霉素抗性）LB的培養(yǎng)基1 mL進行混勻，并置于37 ℃輕搖1 h，吸取100 μL涂抹在含氨芐霉素抗性LB平板中（在37 ℃的環(huán)境平板倒置過夜培養(yǎng)）。從中選取單個菌落加入培養(yǎng)基中并在37 ℃的搖動12 h，經過菌液PCR鑒定（反應體系同1.5），將實驗所得的質粒送達北京金唯智公司進行測序鑒定，測序結果應用UCSC基因組瀏覽器與NCBI軟件所獲的啟動子區(qū)序列，從比對中確認克隆片段序列的正確性。

1.7 雙熒光素酶活性測定

參照生產商說明書，通過24孔板轉染雙熒光質粒24 h后，去除孔內培養(yǎng)基，PBS洗滌兩次，每孔內添加100 μL裂解液，室溫搖動20 min至充分裂解；隨后吸取10 μL裂解產物與50 μL底物進行混合，檢測螢火蟲熒光素酶活性隨后加入50 μL的Stop&Glo Reagent，檢測海腎熒光素酶活性，計算上述兩種熒光素酶活性的比值。

1.8 Transwell 實驗

首先將Matrigel Invasion Chamber（BDBiosciences公司）從-20 °C冰箱放置4 ℃過夜，用50 mg/LMatrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，37 ℃培養(yǎng)箱放置5 h使其凝固。之后分別在上室和下室中加入500 μL無血清培養(yǎng)基，然后放置于37 °C培養(yǎng)箱2 h。用移液器移除上下室中的培養(yǎng)基，下室中加入750 μL含20%血清的培養(yǎng)基。胰酶消化細胞，終止消化后1000r/min離心5 min棄去培養(yǎng)基，用PBS洗1～2遍，用無血清培養(yǎng)基配制細胞濃度為5×104個/mL的單細胞懸液，取500 μL細胞懸液緩慢加入上室，輕輕混勻，定時觀察細胞穿過小室的侵襲情況。小室分別用棉簽小心擦去其上層的細胞。之后用配制好的4%甲醛室溫固定細胞30 min，用Giemsa染液對細胞進行染色，室溫30 min，清水沖洗，室溫風干，用刀片將膜部分小心割下，中性樹膠固定封片。顯微鏡下觀察穿過孔的染色細胞，隨機選取的5個視野拍照并統計細胞數。

1.9 統計學處理

SPSS21.0軟件用于統計學分析，Transwell實驗采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RUNX2 與MMP-3 高表達乳腺癌患者DMFS降低

1902 例原發(fā)性乳腺癌患者腫瘤組織中，RUNX2與MMP-3的mRNA水平呈正相關（r=0.3042，P<0.0001）（圖1A）。在Kaplan Meier Plotter數據庫，RUNX2或MMP-3低表達患者的DMFS（黑色曲線）明顯高于RUNX2或MMP-3高表達患者（紅色曲線）（P=0.034，P=0.013（圖1B）。

圖1 數據庫資料分析 A：RUNX2 與 MMP-3 在乳腺癌中相關性分析；B：RUNX2 與MMP-3 在乳腺癌患者中與DMFS 相關性Figure 1 Database analysis A:Correlation analysis of the relationship between RUNX2 and MMP-3 in breast cancer;B:Correlation analysis of RUNX2 and MMP-3 with DMFS in breast cancer patients

2.2 RUNX2可調節(jié)MDA-MB-231細胞中MMP-3表達水平

qRT-PCR結果顯示，干擾RUNX2后，MDA-MB-231細胞MMP-3 mRNA水平下調（均P<0.05）（圖2A）。Western blot檢測結果顯示，干擾RUNX2 后，MDA-MB-231與BT-549細胞中RUNX2和MMP-3蛋白表達水平均明顯下調，而轉染RUNX2過表達質粒后，MDA-MB-231與BT-549細胞中RUNX2與MMP-3蛋白表達水平均明顯上調（均P<0.05）（圖2B）。以上結果證實，在MDA-MB-231細胞中RUNX2水平可以影響MMP-3表達。

圖2 RUNX2 對MMP-3 表達的影響 A：qRT-PCR 檢測轉染siRUNX2 的MDA-MB-231 中RUNX2 與MMP-3 mRNA；B：Western blot 檢測轉染siRUNX2 及RUNX2 過表達質粒后MDA-MB-231 與BT-549 細胞中RUNX2 與MMP-3 蛋白表達水平Figure 2 The effect of RUNX2 on MMP-3 expression A:The mRNA levels of RUNX2 and MMP-3 in MDA-MB-231 transfected with siRUNX2 detected by qRT-PCR;B:The protein levels of RUNX2 and MMP-3 in MDA-MB-231 and BT-549 cells transfected with siRUNX2 or RUNX2 over-expressed plasmid detected by Western blot

2.3 RUNX2 可以與MMP-3 基因啟動子序列結合

通過生物信息學分析獲得MMP-3轉錄起始位點上游2 kb的啟動子區(qū)序列，發(fā)現MMP-3啟動子序列中存在RUNX2結合位點（5'-ACCACA-3'）（圖3A）。利用ChIP實驗在MDA-MB-231細胞中進行驗證。采用脂質體法用帶有His標簽的RUNX2過表達質粒轉染MDA-MB-231細胞，并用His抗體特異性結合于RUNX2結合的基因啟動子序列，之后進行PCR反應和瓊脂糖凝膠電泳，分析RUNX2對MMP-3啟動子DNA片段的結合。結果顯示，在MDA-MB-231細胞中，RUNX2可以與MMP-3基因啟動子序列結合（圖3B）。

圖3 RUNX2 與MMP-3 相關性驗證 A：Jaspar 預測RUNX2 在MMP-3 基因啟動子區(qū)的結合位點；B：ChIP 實驗檢測RUNX2 與含有或缺乏RUNX2 結合序列的MMP-3 基因啟動子區(qū)的結合作用Figure 3 Verification of the correlation between RUNX2 and MMP-3 A:Predicting the binding site of RUNX2 in the MMP-3 gene promoter using Jaspar;B:The binding of RUNX2 to the MMP-3 promoters containing or lacking RUNX2-binding sequences assessed by ChIP assays

2.4 啟動子區(qū)擴增產物鑒定

為進一步驗證，構建含有或缺乏RUNX2結合位點的MMP-3啟動子區(qū)雙熒光報告質粒。以293T細胞基因組DNA為模板，通過PCR法獲得MMP-3啟動子區(qū)DNA片段，隨后采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對其進行檢測，可見擴增出兩條條帶的狀態(tài)呈單一性，分別位于601 bp和1346 bp處，根據條帶位置可初步判斷出擴增所得的DNA片段為所需的目的DNA片段（圖4）。

圖4 MMP-3 基因包含RUNX2 結合序列啟動子區(qū)及其空白對照PCR 擴增產物電泳圖 M：DL2000DNAMarker；1：不含RUNX2 結合位點MMP-3 基因啟動子PCR 產物；2：含RUNX2 結合位點MMP-3 基因啟動子PCR 產物Figure 4 Electrophoretogram of PCR amplification product of the promoter region of MMP-3 gene containing RUNX2 binding sequence and its blank control M:DL2000DNAMarker;1:PCR products of MMP-3 gene promoter containing no Runx2 binding site;2:PCR products of MMP-3 gene promoter containing Runx2 binding site

2.5 重組質粒的酶切鑒定

通過瓊脂糖凝膠電泳對重組質粒進行雙酶切鑒定，結果顯示，克隆片段與目的序列的理論序列大小一致，初步判斷質粒構建正確（圖5）。

圖5 瓊脂糖凝膠電泳雙酶切鑒定 M：DL5000DNA marker；1：空白對照質粒雙酶切產物；2：含RUNX2結合位點質粒雙酶切產物Figure 5 DNA plasmid identified by restriction endonucleases digestion M:DL5000DNA marker;1:Double digestion products of the empty control plasmids;2:Double digestion products of the plasmids containing RUNX2 binding site

2.6 RUNX2 可調節(jié)MMP-3 雙熒光質粒轉錄活性

將含有RUNX2 結合位點的MMP-3 啟動子序列克隆到pGL3-Basic質粒，構建pGL3-MMP-3及其空白對照熒光報告質粒。通過siRNA沉默MDAMB-231 細胞中RUNX2 后，再分別轉染p GL3-MMP-3 質粒，同時轉染空白質粒作為對照，雙熒光報告素酶系統檢測啟動子轉錄活性。在沉默RUNX2表達的細胞中pGL3-MMP-3轉錄活性低于對照組（圖6），證實RUNX2能夠促進MMP-3啟動子的轉錄活性。

圖6 RUNX2 對MMP-3 啟動子雙熒光報告質粒轉錄活性影響Figure 6 Effects of RUNX2 on transcriptional activity of MMP-3 promoter luciferase reporter plasmids

2.7 RUNX2 和MMP-3 過表達促進乳腺癌細胞侵襲

Transwell方法檢測細胞的侵襲能力發(fā)現，RUNX2過表達的MDA-MB-231、BT-549與對照細胞相比侵襲能力增加，而同時沉默MMP-3表達之后，過表達RUNX2的兩種細胞侵襲能力降低（均P<0.05）（圖7）。

圖7 RUNX2 和MMP-3 過表達對乳腺癌細胞侵襲能力的影響Figure 7 Effect of overexpression of RUNX2 and MMP-3 on the invasion ability of breast cancer cells

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，盡管在診斷、治療及預后評估方面已經取得較大進展，但病死率仍然沒有明顯改善。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因激活與抑癌基因失活密切相關。因此，篩選出與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關的分子遺傳學改變，對于早期診斷、個體化治療及預后分層至關重要。本研究采用多種生物信息學分析方法，發(fā)現乳腺癌患者組織中RUNX2和MMP-3 mRNA水平呈正相關，且高表達RUNX2或MMP-3患者具有更短的DMFS。進一步的分子生物學實驗證實，RUNX2表達水平可以調節(jié)乳腺癌細胞中MMP-3基因的轉錄水平，且兩者過表達可以增強腫瘤細胞的遷移能力，上述結果為乳腺癌的臨床研究提供了潛在的理論基礎。

RUNX2 屬于RUNX 轉錄因子家族成員，通過調控下游基因表達參與細胞增殖分化等過程。RUNX2通過維持成骨細胞和破骨細胞的生成，調節(jié)骨發(fā)育[12-14]。早期研究發(fā)現，RUNX2可參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，包括乳腺癌、胰腺癌、肝癌等[15-18]，其中越來越多的證據支持RUNX2在浸潤性乳腺癌中發(fā)揮重要作用。與正常乳腺上皮細胞相比，RUNX2在浸潤性乳腺癌細胞系中被發(fā)現上調[19]，是浸潤性和非浸潤性乳腺癌細胞比較篩選中確定的基因之一[20]。RUNX2過表達與乳腺癌的侵襲以及骨轉移有關[5]。

侵襲和轉移是導致乳腺癌進展及患者死亡的主要原因[21-22]。腫瘤細胞啟動轉移時，細胞首先要失去黏附力，運動并侵入ECM，隨后進入循環(huán)系統，最終在遠處的組織和器官中定植形成轉移灶[23-24]。ECM的蛋白水解是腫瘤侵襲及轉移過程中的關鍵步驟，也是是血管生成和腫瘤細胞浸潤的重要因素。研究[26-28]表明MMP在負責ECM的降解中起到關鍵作用[25]，MMP-1，-2，-3，-7，-9，-13和-14的上調與乳腺癌細胞的侵襲有關。早期研究[26]發(fā)現MMP-3過表達可導致小鼠乳腺腫瘤的形成。此外，據報道[27]MMP-3的表達水平在乳腺癌細胞中上調并與乳腺癌存活率相關。

盡管RUNX2 和MMP-3 在乳腺癌進展中發(fā)揮重要的促進作用，但有關兩者間相互作用關系的研究非常有限。本研究聯合數據庫分析發(fā)現，乳腺癌組織RUNX2 mRNA與MMP-3 mRNA表達水平呈正相關，高表達RUNX2 或MMP-3 的乳腺癌患者的DMFS均顯著降低，提示RUNX2和MMP-3能提高乳腺癌患者的復發(fā)與轉移。RUNX2能夠促進乳腺癌細胞MMP-3 表達，提示RUNX2 很可能通過調節(jié)MMP-3表達增強乳腺癌細胞侵襲能力。經過Transwell實驗驗證發(fā)現，過表達RUNX2可以增強腫瘤細胞的侵襲能力，若在過表達RUNX2的乳腺癌細胞中下調MMP-3表達，則可以抑制細胞侵襲。由此，筆者推測RUNX2很可能通過調節(jié)MMP-3的表達參與乳腺癌細胞的侵襲。早期研究發(fā)現，RUNX2還可調節(jié)MMP2、MMP9和MMP13表達參與腫瘤的轉移和侵襲[29-30]。由于MMP-3可以激活多種MMP，包括proMMP-1、-3、-7、-8、-9和-13[28]，因此，RUNX2 除了結合到MMP9、MMP13 啟動子區(qū)并直接調控其轉錄，還可能間接通過促進MMP-3 的表達進而激活MMP9 以及MMP13。因此，盡管單個金屬蛋白酶的表達雖然不足以使乳腺腺癌進展為侵襲性和轉移性表型，但是可以通過多種基質金屬酶的協作促進乳腺癌侵襲過程，而這個階段正是針對乳腺癌疾病治療的關鍵環(huán)節(jié)，應引起足夠重視。

總之，本研究首次報道了RUNX2可以通過調節(jié)MMP-3表達影響乳腺癌細胞侵襲能力，為乳腺癌治療的臨床及基礎研究提供了潛在的理論基礎。