張玉云，丁 軻，李 旺，余祖華，李元曉

(1.河南科技大學(xué) 宏翔生物飼料實驗室，河南 洛陽 471023；2.洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，河南 洛陽 471023)

0 引言

隨著中國養(yǎng)牛業(yè)集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展，牧場牛糞多以集中處理的方式進行排放，處理不當(dāng)將導(dǎo)致嚴重的環(huán)境污染。同時，牛糞中有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，若能合理利用，可作為重要的再生資源[1]。文獻[2-3]研究發(fā)現(xiàn)：新鮮牛糞含碳27.1%(質(zhì)量分數(shù)，下同)、氮1.57%、磷0.4%、鉀0.6%、粗蛋白3.14%、糖7.53%、淀粉4.62%，是發(fā)酵有機肥的重要資源。然而，牛糞中的纖維素含量較高且很難被利用，造成了資源浪費。因此，如何高效降解牛糞中纖維素已成為當(dāng)前養(yǎng)牛業(yè)廣泛關(guān)注的問題[4]。

纖維素的降解需選育高效纖維素降解菌株。目前，學(xué)者們研究和應(yīng)用的纖維素降解菌多以細菌和真菌為主，尤以木霉、曲霉及芽孢桿菌居多[5]。文獻[6]研究報道了一株纖維素降解真菌煙曲霉HZ1，其基因組中包含豐富的纖維素酶基因，包括25個內(nèi)切葡聚糖酶基因、7個外切葡聚糖酶基因和23個β-葡萄糖苷酶基因，表明了其巨大的纖維素降解潛力。文獻[7]從土壤中篩選出1株高效纖維素降解菌BacilluspumilusWL-2，其酶活為0.005 3 U/mL，可為開發(fā)纖維素降解菌資源提供參考。文獻[8]從牛糞中分離出4株有纖維素水解圈的菌XQ-1、XQ-2、XQ-3和XQ-4，經(jīng)鑒定XQ-1為大腸埃希菌，XQ-2為黏質(zhì)沙雷菌，XQ-3為雷氏普羅威登斯菌，XQ-4為費格森埃希菌，這些細菌可用于纖維素基質(zhì)的有效生物降解。本試驗從新鮮牛糞樣品中分離篩選出一株產(chǎn)纖維素酶活較高的菌株NA10，通過形態(tài)特征、生理生化及16S rDNA序列分析進行鑒定，并對其纖維素酶活進行初步測定，為進一步制備復(fù)合微生態(tài)發(fā)酵制劑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

試驗樣品為采集于洛陽某養(yǎng)牛場的新鮮牛糞和腐熟牛糞。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基含羧甲基纖維素鈉1 g、磷酸氫二鉀0.1 g、氯化鈉0.01 g、七水硫酸鎂0.03 g、硫酸銨0.15 g、三氯化鐵0.000 1 g、磷酸二氫鉀0.05 g、蒸餾水100 mL。羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基含磷酸氫二鈉0.5 g、蛋白胨0.5 g、氯化鈉0.5 g、酵母膏0.1 g、七水磷酸二氫鉀0.3 g、羧甲基纖維素鈉2 g、蒸餾水200 mL。增菌培養(yǎng)基含牛肉膏1.0 g、蛋白胨2.0 g、氯化鈉1.0 g、瓊脂4 g、蒸餾水200 mL。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基含羧甲基纖維素鈉1 g、硫酸銨0.2 g、蛋白胨0.3 g、酵母膏0.02 g、磷酸二氫鉀0.4 g、七水硫酸鎂0.03 g、蒸餾水100 mL。

1.1.3 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒，購于北京艾德萊生物科技有限公司；瓊脂糖、GoldView核酸染色劑；6×Loading Buffer、Marker DL 2000、PreMix、50×TAE，均購于生工生物工程(上海)股份有限公司；化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器

超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號為SW-CJ-1FD)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，型號為DH6-924385-Ⅲ)，紫外分光光度計(上海翱藝儀器有限公司，型號為UV-1200)，高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠，型號為LDZX-50KBS)，恒溫水浴鍋(上海申安醫(yī)療器械廠，型號為XMTD-4000)，恒溫搖床(金壇市醫(yī)療儀器廠，型號為THZ-82B)，PCR儀(西安天隆科技有限公司，型號為DTC)，電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號為JY600C)等。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集培養(yǎng)

取新鮮牛糞和腐熟牛糞各10 g,分別加入裝有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，于37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，振蕩均勻制備成樣品混懸液。吸取200 μL樣品混懸液,加入裝有100 mL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中,于37 ℃搖床中培養(yǎng)2～3 d。在超凈工作臺中，吸取富集液體(10-1)100 μL,加入900 μL的無菌生理鹽水中吹打混勻,即得10-2稀釋液，依次稀釋到10-8。取10-5、10-6、10-7的稀釋液100 μL,涂布于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，每個梯度涂3個平板，分別于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株的分離與篩選

無菌挑取顏色、形態(tài)不一的單菌落在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，重復(fù)劃線2～3次，直到得到較純的菌株。挑選單菌落于增菌培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，然后分別吸取2 μL點種到羧甲基纖維素鈉平板中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，用質(zhì)量分數(shù)為0.5%的碘液浸染1 min，觀察菌落周圍有無透明圈。將有透明圈的菌株于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株纖維素酶活測定

采用3，5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic,DNS)法測定纖維素酶活(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶,cellulose enzyme activity,CMC)和濾紙酶活(filter paper enzyme activity,FPA)，酶活單位為U/mL(定義為在一定條件下，1 mL粗酶液每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需酶量)。

葡萄糖曲線的繪制：取6個25 mL具塞刻度試管，分別加入葡萄糖標準溶液(1.0 mg/mL)0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，再分別加入蒸餾水2.0 mL、1.6 mL、1.2 mL、0.8 mL、0.4 mL、0 mL，然后吸取3，5-二硝基水楊酸顯色劑1.5 mL分別加入試管中，在沸水浴中煮沸顯色10 min，冷卻，加純凈水定容至10 mL，搖勻。以1 mL蒸餾水代替葡萄糖作空白管，在540 nm處測吸光度。以吸光值為縱坐標，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，繪出葡萄糖標準曲線，如圖1所示。

酶液的制備：將有透明圈的菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基，置于37 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，然后在離心機中以8 000 r/min離心10 min，收集上清液，留作待測酶液。

測定步驟：參照文獻[9]的方法稍作改動。①β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶酶活測定：取25 mL比色管4支(1支作為對照，3支作為樣品管)，樣品管中加入稀釋至100倍的粗酶液0.5 mL，加入3 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的CMC-Na溶液；對照管中加入1 mL酶液，沸水浴5 min，冷卻加3 mL 1%CMC-Na溶液，與樣品管同時放入50 ℃水浴反應(yīng)30 min后,加入3 mL DNS試劑在沸水浴煮沸10 min，取出立即流水冷卻，然后加純凈水定容至10 mL，在540 nm測吸光度。計算公式為：CMC酶活=P×1 000×稀釋倍數(shù)/0.5×180×30，其中：P為葡萄糖質(zhì)量濃度,mg/mL；0.5為酶液量,mL；30為糖化時間,min;180為葡萄糖相對分子質(zhì)量。②濾紙酶活：取25 mL比色管4支(1支作為對照，3支為樣品管)，樣品管中加入稀釋至100倍的粗酶液0.5 mL，再放入50 mg(長6 cm，寬1 cm)的濾紙條，然后加入1 mL、0.1 mol/L、pH4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液；放有濾紙條的對照管中加入1 mL酶液，沸水浴5 min，冷卻，加1 mL、0.1mol/L、pH4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液，與樣品管同時放入50 ℃水浴反應(yīng)60 min后,加入3 mL DNS試劑，在沸水浴煮沸10 min，取出后立即流水冷卻，然后加純凈水定容至10 mL，在540 nm測吸光度。計算公式：FPA(U/mL)=(葡萄糖質(zhì)量濃度×酶液定容總體積)/(樣品體積×反應(yīng)時間)。

1.2.4 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株在增菌培養(yǎng)基上純化劃線，使其長出單個菌落，觀察其形態(tài)大小，并挑取少許菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.5 菌株的生理生化鑒定

菌株的生理生化特征依據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》[10]進行鑒定。

1.2.6 菌株的16S rDNA鑒定

利用細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取分離菌株的全基因組，以DNA為模板加入細菌通用引物，上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物1429R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，進行聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)。PCR體系為：PremixTaq12.5 μL，模板1 μL，上游引物、下游引物各1 μL，加蒸餾水至25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠檢測。將符合要求的PCR產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司測序。登錄美國國立生物技術(shù)中心網(wǎng)站，將所測序列提交到GenBank中進行BLAST分析，選取并下載同源性較高的序列，運用MEGA5.2軟件包中的Kimura2-parameter法計算遺傳距離，運用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株初篩結(jié)果

以新鮮牛糞和腐熟牛糞為樣品，篩選出了56株菌株，利用點接法將菌株點接在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，并結(jié)合革蘭氏碘液進行染色，初步獲得13株具有纖維素降解能力的菌株。測量水解圈直徑(H)和菌落直徑(C)，并計算水解圈和菌落直徑比值(H/C)，結(jié)果如表1所示。菌株H/C為1.06～5.35，其中菌株NA10產(chǎn)纖維素酶能力最強。

2.2 菌株NA10的纖維素酶活測定結(jié)果

對菌株進行纖維素酶活的測定能進一步確定菌株的纖維素降解能力。采用DNS法對菌株NA10進行纖維素酶活測定，并對其進行纖維素酶活和濾紙酶活測定，試驗重復(fù)3次，求平均值。試驗結(jié)果測得NA10的CMC和FPA分別為55.13 U/mL和35.47 U/mL，進一步證明了菌株NA10的纖維素降解能力，并對其進行進一步研究。

2.3 菌株NA10的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

將菌株NA10在NA培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)后，觀察菌落形態(tài)、質(zhì)地、邊緣及顏色等，并拍照保存，結(jié)果如圖2所示。由圖2a可看出：菌株NA10菌落呈圓形，乳白色不透明，邊緣突起，中間輕微凹陷或者圓形實質(zhì)。挑取少許菌落進行革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，可看出菌株革蘭氏染色為陽性，菌落兩頭鈍圓呈桿狀、有中生芽孢，見圖2b。

2.4 菌株NA10的生理生化鑒定結(jié)果

選取透明圈較大的菌株NA10進行生理生化實驗，結(jié)果見表2。菌株NA10為革蘭氏陽性需氧菌，37 ℃中溫菌，能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖和木糖產(chǎn)酸，說明菌株能利用多種糖類物質(zhì)作為碳源。酶類試驗結(jié)果表明：菌株NA10能產(chǎn)脲酶、蛋白酶、氧化酶及半乳糖苷酶，且能水解淀粉酶，但明膠液化和過氧化氫酶水解呈陰性；VP實驗、吲哚實驗、甲基紅及硫化氫還原反應(yīng)均呈陰性；硝酸鹽和檸檬酸鹽還原為陽性。根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》[10]可初步判定菌株NA10為芽孢桿菌屬(Bacillus)。

表2 菌株NA10的生化鑒定結(jié)果

2.5 菌株NA10的16S rDNA鑒定結(jié)果

以菌株NA10的DNA為模板，利用細菌通用引物進行PCR擴增，采用1%(質(zhì)量分數(shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測其PCR產(chǎn)物，并得到了長度為1 500 bp左右的目的條帶(見圖3)，與預(yù)期結(jié)果基本一致。將PCR產(chǎn)物送到上海生物工程有限公司測序，測序結(jié)果表明菌株NA10的序列長度為1 450 bp。

M.DL2000Mark；1～3.PCR產(chǎn)物3次重復(fù)

將測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)中心網(wǎng)站中已有的16S rDNA序列進行BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株NA10與安全芽孢桿菌和短小芽孢桿菌兩個株菌的相似度較高，挑選出與該菌株基因相似的菌株14株，通過MEGA7.0軟件中的“Neighbor-Joining(NJ)”模塊對該序列進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知：菌株NA10與Bacillussafensisstrain MIT1 MT669372.1在進化樹上處于同一個分支，同源性高達99.72%，親緣關(guān)系最近，因此，可鑒定該菌株為安全芽孢桿菌(Bacillussafensis)，命名為BacillussafensisNA10。

圖4 菌株NA10基于16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹

3 討論

本試驗以羧甲基纖維素鈉為底物來分離纖維素降解菌，再結(jié)合0.5%碘液染色,根據(jù)纖維素酶解圈進一步排除一些不能利用羧甲基纖維素鈉的菌株，這種方法排除了不必要的雜菌。進一步進行纖維素酶活測定，篩選出一株纖維素酶活較高的菌株NA10，通過形態(tài)學(xué)、生化試驗及16S rDNA基因序列鑒定，該菌株為芽孢桿菌屬的安全芽孢桿菌(Bacillussafensis)，3種鑒定結(jié)果相結(jié)合，準確可靠。文獻[11-15]研究發(fā)現(xiàn):安全芽孢桿菌在試驗中不僅能發(fā)酵各種糖產(chǎn)酸，而且在產(chǎn)酶方面比較強，且耐鹽，很早以前就有研究報道從土壤、海水、動物排泄物及昆蟲腸道中分離出了具有不同功能的安全芽孢桿菌，比如有的在Oxidase反應(yīng)中呈陽性，能產(chǎn)氧化氫酶、堿性磷酸酶、β葡糖苷酶、酯酶、胰蛋白酶、色氨酸脫氨酶、幾丁質(zhì)酶和脂肪酶等多種酶，也有的對酪蛋白、淀粉水解呈陰性，但檸檬酸鹽利用呈陽性，且能廣泛利用多種糖類、酯類等物質(zhì)。本試驗篩選的安全芽孢桿菌NA10不僅能水解酪蛋白及淀粉酶，還能產(chǎn)除了過氧化氫酶以外的多種酶，以纖維素為底物發(fā)現(xiàn)還能產(chǎn)纖維素酶，與文獻研究對比存在差異，可能是與培養(yǎng)條件及環(huán)境影響有關(guān)，或者因其與短小芽孢桿菌高度相似的特異性基因型有關(guān)。此外,文獻[16]研究發(fā)現(xiàn):安全芽孢桿菌MS11對砷、硼、鎘、鉻、銅、鎳、鉛和鋅等重金屬具有較高的抗性。文獻[17]報道了另外414種從碳氫化合物和重金屬污染場地分離出的耐重金屬安全芽孢桿菌BBN7，該菌株對阿莫西林、青霉素、頭孢菌素、頭孢他啶、頭孢噻肟和氨香豆素等抗生素表現(xiàn)出耐藥性，不僅可促進植物生長、抑制病蟲害，還能進行生物修復(fù)，其功能應(yīng)用廣泛，已得到證實。由此可見，安全芽孢桿菌作為益生菌在生物技術(shù)應(yīng)用方面較為廣泛，不僅能應(yīng)用到農(nóng)業(yè)方面，在發(fā)酵有機肥方面也有很大潛力。

根據(jù)文獻[18-20]研究發(fā)現(xiàn):測定纖維素酶活的方法有很多，但其測定結(jié)果受到測定酶活的反應(yīng)條件如反應(yīng)溫度、pH、發(fā)酵時間和酶液濃度等因素的影響，另外，碳源、氮源及反應(yīng)底物等也是產(chǎn)纖維素酶活的主要影響因素。NA10的CMC和FPA分別為55.13 U/mL和35.47 U/mL，此酶活結(jié)果高于文獻[21]報道的蠟狀芽孢桿菌(4.12 U/mL)及文獻[22]報道的地衣芽孢桿菌(0.10 U/mL)的酶活，但低于文獻[23]報道的枯草芽孢桿菌(358.28 U/mL)的酶活，可能是因為安全芽孢桿菌的多種產(chǎn)酶特性導(dǎo)致其單一酶活不高，或者菌株在后期生長衰退，菌體細胞進行了自溶或者進入凋亡期，還可能受到了環(huán)境條件、培養(yǎng)基成分及產(chǎn)酶發(fā)酵時間等因素的影響，導(dǎo)致酶的分泌減少。此次分離的有效菌株中NA10的酶活最高，這在以往的研究中還沒有報道，后期將會對該菌株的酶學(xué)特性進行研究，對其產(chǎn)酶條件進一步優(yōu)化，使其在最佳發(fā)酵條件下發(fā)揮潛能。此外，還需要研究該菌株應(yīng)用到動物糞便中的纖維素降解效率，及其在堆肥過程中的除臭效果，為動物糞便中纖維素降解菌的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

從牛糞中分離到1株芽孢桿菌NA10，該菌高產(chǎn)纖維素酶，耐鹽，產(chǎn)酸，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生化反應(yīng)試驗以及16S rDNA基因測序，鑒定為安全芽孢桿菌。