吳萬億，張 毅，張 潔，董靜靜，唐銳敏，賈小云，張紅梅

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是全球第四大重要的糧食作物[1]，僅次于水稻、小麥和玉米，是食品和工業(yè)加工的重要原料來源[2]，其中，紫肉馬鈴薯的塊莖中積累了豐富的花青素，是開發(fā)功能性食品的理想資源[3]。

花青素因其具有自由基清除能力，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤和免疫活性調(diào)節(jié)等作用[4-5]，作為植物類黃酮生物合成的主要次生代謝產(chǎn)物，隨pH值不同使花、果實等器官呈現(xiàn)不同顏色[5-6]?；ㄇ嗨氐纳锖铣砂l(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，從苯丙氨酸開始，經(jīng)過多次酶促反應(yīng)、甲基化、糖基化和?；揎椇筠D(zhuǎn)運(yùn)到液泡或細(xì)胞壁中儲存[7]。這一過程由眾多的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因和其他調(diào)控因子參與。關(guān)于結(jié)構(gòu)基因編碼的酶的催化作用，已在多種植物中有了深入研究。研究發(fā)現(xiàn)，二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）是花青素生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，通過與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽（NADPH）共同作用，選擇性地催化二氫櫟皮黃酮（DHQ）、二氫堪非醇（DHK）和二氫楊梅黃酮（DHM）形成不同類型的花青素[8-9]，最終使植物葉片、花、果實呈現(xiàn)不同顏色。LOU等[10]研究表明，麝香蘭中DFR催化DHM使其花色呈現(xiàn)藍(lán)色，而在草莓[11]中DFR催化DHK使其果實呈現(xiàn)紅色。過表達(dá)橙花龍膽GlaDFR1和GlaDFR2基因的轉(zhuǎn)基因煙草花色加深[12]。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200 nt，沒有長的開放閱讀框，不具有蛋白編碼能力或編碼能力很低的非編碼RNA[13]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的lncRNA被不斷發(fā)現(xiàn)。它們可以通過多種方式產(chǎn)生，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平以順式、反式作用的方式調(diào)控其下游基因的表達(dá)[14]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些lncRNA廣泛參與植物的整個生命活動過程[15-18]。近年來，在少數(shù)植物中發(fā)現(xiàn)，一些lncRNA參與了花青素的合成調(diào)控[19-22]。迄今為止，對于參與花青素合成的lncRNA的深入研究大多集中在地上器官（花、葉、果），但紫肉馬鈴薯塊莖中的花青素是在黑暗條件下合成積累的[17]。目前，關(guān)于lncRNA對馬鈴薯塊莖中花青素的合成調(diào)控作用尚未報道。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)課題組前期對希森8號和晉16這2種不同薯肉顏色的馬鈴薯塊莖進(jìn)行l(wèi)ncRNA轉(zhuǎn)錄組高通量測序，篩選到在2個品種中差異表達(dá)的lncRNA-LINC4206，通過構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測到StDFR為其靶基因。本研究克隆了LINC4206及其靶基因StDFR，采用生物信息學(xué)方法分析了StDFR基因的編碼蛋白，并利用RT-qRCR進(jìn)行差異表達(dá)分析，旨在為后續(xù)解析lncRNA調(diào)控花青素生物合成的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時也為研究lncRNA對地下器官中花青素合成調(diào)控機(jī)制提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試馬鈴薯品種為希森8號（紫皮紫心）和晉16（黃皮黃心）。其中，希森8號由山東省樂陵市西森馬鈴薯產(chǎn)業(yè)有限公司提供，晉16保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院。將4周齡的組培苗在溫室（22±1）℃、光14 h/暗10 h條件下培養(yǎng)，經(jīng)馴化移栽大田。3個月后，采收新鮮塊莖進(jìn)行l(wèi)ncRNA測序。每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)來自于3個生長狀況良好且一致的馬鈴薯塊莖。

植物RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物公司，Prime ScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR ScriptTMRT reagent KitⅡ試劑盒、DNA Marer和pMDTM19-T Vector試劑盒均購自TaKaRa公司，2×Taq Master Mix購自康為世紀(jì)公司，DNA片段純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司，氨芐霉素購自索萊寶公司。大腸桿菌感DH5α菌株由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1LINC4206與StDFR基因的克隆 根據(jù)課題組lncRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫提供的LINC4206、StDFR的核苷酸序列，分別設(shè)計克隆引物，引物序列如表1所示。

表1 LINC4206及StDFR的克隆引物

根據(jù)CTAB法[23]提取希森8號馬鈴薯塊莖基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增LINC4206，擴(kuò)增總體系為50μL：2×Taq Master Mix 25μL，10μmol/LLINC4206-PF/PR各2μL，DNA 3μL，ddH2O 18μL；擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃終延伸2 min。按華越洋多酚多糖植物RNA提取試劑盒說明書提取RNA，cDNA的合成參照Prime ScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增St DFR，擴(kuò)增總體系為50μL：2×Taq Master Mix 25μL，10μmol/LStDFR-PF/PR各2μL，cDNA 3μL，ddH2O 18μL；擴(kuò)增程序為：94℃2 min；94℃30 s，58℃1 min，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃2 min。將LINC4206及StDFR的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，分別連接至載體pMDTM19-T并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)；次日挑取單克隆鑒定，經(jīng)過PCR菌液檢測送至上海生工公司進(jìn)行測序。其余菌液及質(zhì)粒保存于-80℃，備用。

1.2.2St DFR基因的生物信息學(xué)分析 通過使用表2在線軟件對StDFR基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

表2 生物信息學(xué)分析所用軟件

1.2.3LINC4206與StDFR基因的表達(dá)模式分析根據(jù)課題組lncRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫提供的LINC4206及StDFR的核苷酸序列分別設(shè)計特異性引物（表3），分別以晉16和希森8號的塊莖cDNA為模板，參照實時熒光定量試劑盒說明書，通過BIO-RAD CFX 96熒光定量儀對LINC4206及StDFR這2個基因在2個不同品種馬鈴薯塊莖中的表達(dá)水平進(jìn)行RT-qPCR分析，同時以StEF1α為內(nèi)參基因，每個樣品3個技術(shù)重復(fù)。

表3 試驗中用到的定量特異性引物

2 結(jié)果與分析

2.1 LINC4206和StDFR基因的克隆

LINC4206-PF/PR和StDFR-PF/PR為克隆引物，分別以希森8號基因組DNA和cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，在2條泳道上各得到了一條特異性條帶，且2條帶大小不一（圖1-A），長度符合預(yù)期，初步判斷為目的片段；將這2條目的條帶回收、連接載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、挑單克隆后進(jìn)行菌落PCR，經(jīng)檢測，2個目的片段大小與前面結(jié)果一致（圖1-B、C）。將陽性菌落擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒DNA，測序可知，序列長度分別為816、1149 bp。

2.2 StDFR生物信息學(xué)分析

經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析，結(jié)果顯示（圖2），StDFR基因編碼的蛋白分子量為42469.78，分子式為C1912H2987N491O565S18，原子總數(shù)為5973，等電點為5.71，不穩(wěn)定系數(shù)為31.77，總平均親水性為-0.171，是一個親水性穩(wěn)定蛋白，且無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽。亞細(xì)胞定位預(yù)測StDFR蛋白最有可能被定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜。

二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、β折疊和延伸鏈構(gòu)成，其中，無規(guī)則卷曲和α-螺旋占比最多，分別為43.98%和36.65%，β折疊和延伸鏈占比較少，分別為6.28%和13.09%（圖3）。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示（圖4），建模模板為2c29.1.A，在第18—341氨基酸處建模，序列相似度為71.99%，模型覆蓋率達(dá)到87%。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在氨基酸序列的第20—259位殘基之間有一個典型的差相異構(gòu)化結(jié)構(gòu)域（epimerase）；StDFR基因編碼NAD（P）結(jié)合的折疊超家族蛋白質(zhì)，屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族。

在NCBI下載甜櫻桃（Prunus avium）、野草莓（Fragaria vesca）、大豆（Glycine soja）、辣椒（Capsicum annuum）、龍眼（Dimocarpus longan）、水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotiana tabacum）、番茄（Solanum lycopersicum）、茄子（Solanum melongena）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）等多種植物的DFR蛋白序列，運(yùn)用MEGA構(gòu)建進(jìn)化樹，分析發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯與同屬于茄科的番茄、茄子、煙草聚集在一起，說明其與這3個物種的親緣關(guān)系較近，與茄子最近（圖5）。

2.3 LINC4206與StDFR基因的表達(dá)模式分析

為了探究LINC4206在馬鈴薯塊莖花青素的生物合成中是否發(fā)揮作用，利用RT-qPCR方法分析了LINC4206及StDFR在晉16和希森8號塊莖中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6所示，LINC4206和StDFR在這2個品種中均有表達(dá)，且均在希森8號中的表達(dá)量較高，在晉16中表達(dá)量較低，推斷LINC4206可能靶向作用于StDFR進(jìn)而正調(diào)控馬鈴薯花青素的合成積累。

3 結(jié)論與討論

近年來，一些lncRNA被發(fā)現(xiàn)參與植物生長、花果發(fā)育、脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過程。例如，擬南芥COOLAIR和COLDAIR通過抑制開花基因來實現(xiàn)快速開花轉(zhuǎn)變[16-17]；水稻LDMAR通過調(diào)控DNA甲基化導(dǎo)致雄性不育[18]；TAS3通過氮響應(yīng)以促進(jìn)側(cè)根發(fā)育[24]；番茄lncRNA1459與番茄果實成熟相關(guān)，lncRNA1459的缺失會抑制乙烯的產(chǎn)生和番茄紅素的積累[25]；lnc39042可以與靶基因SLP100協(xié)同作用提高番茄的抗病性。毋若楠等[26]研究表明，將lncRNA在擬南芥中過表達(dá)后，擬南芥的耐旱性提高。在少數(shù)植物中也發(fā)現(xiàn)lncRNA參與了花青素的生物合成。

本課題組通過前期對紫色肉質(zhì)和黃色肉質(zhì)馬鈴薯塊莖的轉(zhuǎn)錄組測序，基于lncRNA-mRNA的相關(guān)性構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，篩選出在晉16和希森8號中差異表達(dá)的lncRNA，并進(jìn)一步在希森8號中成功克隆得到了LINC4206及其靶基因StDFR，其片段大小分別為816、1149 bp。采用RT-qPCR對LINC4206和StDFR差異表達(dá)分析結(jié)果表明，LINC4206可能促進(jìn)StDFR的表達(dá)，進(jìn)而正調(diào)控馬鈴薯花青素合成積累。楊拓[21]研究發(fā)現(xiàn)，光可以誘導(dǎo)MLNC3.2和MLNC4.6結(jié)合miRNA156a，進(jìn)而減少其對SPL2-like和SPL33的剪切，從而促進(jìn)蘋果中花青素的積累。趙亞楠等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Mul-CHSAS通過抑制Mul-CHS的表達(dá)進(jìn)而負(fù)調(diào)控花青素合成。此外，ZHANG等[19]通過高通量測序技術(shù)不僅鑒定出了在沙棘果實發(fā)育過程中差異表達(dá)的lncRNA，并且發(fā)現(xiàn)了LNC1和LNC2通過抑制SPL9和MYB114的表達(dá)負(fù)調(diào)控花青素的合成。

本研究對StDFR進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，其有一個典型的epimerase結(jié)構(gòu)域，該基因編碼NAD（P）結(jié)合的折疊超家族蛋白，屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，同為雙子葉植物的馬鈴薯StDFR，與同屬雙子葉植物的茄子SmDFR、番茄SlDFR和煙草NtDFR有較近的親緣關(guān)系；但與同屬茄科的矮牽牛的蛋白結(jié)構(gòu)不同，StDFR蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜，無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽，而矮牽牛蛋白定位于線粒體上，具有信號肽和轉(zhuǎn)移肽，屬于跨膜蛋白，說明DFR在同一茄科不同屬的植物中特性可能有所不同。

本研究對StDFR的生物信息學(xué)分析和差異表達(dá)分析表明，LINC4206可能促進(jìn)靶基因StDFR的表達(dá)而正調(diào)控花青素合成，為研究lncRNA在調(diào)控地下器官中花青素的生物合成方面提供了參考，對培育專用于各種高附加值產(chǎn)品的馬鈴薯新品種具有指導(dǎo)意義。但是本研究僅對lncRNA及其靶基因進(jìn)行了RT-qPCR分析，對于LINC4206及其靶基因StDFR在花青素合成中的調(diào)控機(jī)制還尚未知，后續(xù)需要分別構(gòu)建LINC4206和StDFR的過表達(dá)載體和缺失表達(dá)載體及遺傳轉(zhuǎn)化等功能驗證，以便深入研究LINC4206在馬鈴薯花青素合成中的調(diào)控作用。