夏曉楓， 車彪， 覃松， 劉駿， 羅斌

(長江航運(yùn)總醫(yī)院 骨外科， 湖北 武漢 430014)

椎間盤退行性疾病是臨床骨科常見疾病，多表現(xiàn)為脊柱贅生物形成、椎間隙狹窄、椎間盤突出等臨床特征。盡管牽引療法、開放性手術(shù)、消融術(shù)等都可給椎間盤退行性疾病患者帶來一定的臨床收益[1-3]，但目前尚未有任何方法能夠完全逆轉(zhuǎn)椎間盤退變趨勢。椎間盤退行性疾病是在多種因子作用下導(dǎo)致椎間盤脊髓細(xì)胞各膠原水平及數(shù)量變化所產(chǎn)生的結(jié)果，探討影響膠原動態(tài)變化的相關(guān)因子對于幫助臨床醫(yī)師認(rèn)識椎間盤退行性疾病具有重要的臨床意義[4]。國內(nèi)外研究指出，沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator1，SIRT1)可影響細(xì)胞衰老進(jìn)程[5-6]，楊宜锜等[7]的研究則明確指出SIRT1可對骨代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，盡管SIRT1基因表達(dá)水平與椎間盤退行性疾病或椎間盤退變相關(guān)細(xì)胞間存在一定的關(guān)系，但目前對于SIRT1基因如何影響椎間盤退行性病變的作用機(jī)制尚未完全清楚。Ⅰ型膠原(type-Ⅰ collagen，ColⅡ)、Ⅱ型膠原(type-Ⅱ collagen，ColⅡ)和Ⅹ型膠原(type-X collagen，Col X)水平的改變與骨細(xì)胞凋亡和衰老密切相關(guān)，而SIRT1可能通過影響膠原水平從而作用于椎間盤退行性改變[7]。為進(jìn)一步分析SIRT1在椎間盤中的作用，本研究以Col2-CreSIRT1co/co(SIRT1+/+)小鼠作為動物模型，觀察敲除SIRT1后小鼠軟骨組織中ColⅡ、ColⅡ及ColX等膠原的動態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 SIRT1co/co小鼠(白色，雄性)和Col2-CreERT2小鼠(黑色，雌性)均購自于美國杰克遜實驗室。

1.1.2主要試劑及儀器 他莫昔芬(北京凱瑞基生物科技有限公司)，戊巴比妥鈉(棗莊水泰嵐化工有限公司)，甲醛溶液(廈門慧嘉生物科技有限公司)，蘇木精-伊紅(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)，胰酶(北京凱瑞基生物科技有限公司)，考馬斯亮藍(lán)(上海金穗生物科技有限公司)，SIRT1引物[生工生物工程(上海)有限公司]，山羊抗兔ColⅡ、ColⅡ及ColX一抗(均購自上海江萊生物科技有限公司)，核酸蛋白測定儀(Thermo Fisher，上海艾研生物科技有限公司)、3.0T核磁共振(Achieva，飛利浦)、數(shù)字化X光機(jī)(島津，日本)。

1.2 方法

1.2.1分組 所有小鼠均飼養(yǎng)于二級動物房內(nèi)，12 h明暗循環(huán)(明7 ∶00～19 ∶00，暗19 ∶00～次日7 ∶00)，清潔飲水、自由飲食。取出生6周的Col2-CreERT2小鼠與SIRT1co/co小鼠交配，挑選基因型為Col2-CreSIRT1co/co(SIRT1+/+)的小鼠為研究對象，取6周齡小鼠15只，Col2-CreSIRT1co/co小鼠腹腔注射10 g/L的他莫昔芬(75 mg/kg給藥)誘導(dǎo)小鼠組織中的SIRT1基因敲除獲得SIRT1-/-小鼠作為試驗組；另取30只SIRT1+/+小鼠隨機(jī)分為正常組及模型組，每組15只，均腹腔注射等體積的生理鹽水(1次/d、連續(xù)5 d)。

1.2.2造模及樣本收集 取模型組、試驗組小鼠，俯臥位并固定四肢，頸后部剃毛備皮準(zhǔn)備，消毒鋪巾后肌注2%戊巴比妥鈉(以40 mg/kg給藥)麻醉小鼠，沿腰背部棘突上正中切口，并沿骨膜剝離、去除L1～L6椎間棘突、關(guān)節(jié)突、棘間韌帶、棘上韌帶等，兩側(cè)豎棘肌切斷后檢查是否切除干凈，檢查完全后逐層縫合筋膜、皮膚，術(shù)后肌注50 000 U青霉素抗感染，連續(xù)3 d；正常組行假手術(shù)，采用試驗組同樣的方法麻醉、消毒，但僅做切口后縫合，術(shù)后也給予抗感染處理。所有小鼠行手術(shù)后均單獨放置于飼養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，正常給食、喂水，同等溫濕度下喂養(yǎng)。術(shù)后第4、8及12周時，每組隨機(jī)選取5只小鼠，均腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉后處死，完整取下上下軟骨板與椎體交界處的L5～L6椎間盤，用于后續(xù)實驗。

1.2.3X線片及組織學(xué)檢查 3組小鼠于手術(shù)第4周時行X線片檢查并記錄結(jié)果，并將1.2.2項下得到的椎間盤組織于10%甲醛溶液中固定、固定完全后流動水沖洗，并梯度乙醇脫水，浸蠟包埋并做石蠟切片，HE染色，正置生物顯微鏡下觀察。

1.2.4軟骨組織中SIRT1表達(dá) 取術(shù)后第4周獲得的椎間盤軟骨組織樣本，剪碎組織小塊后胰酶消化，過濾、離心后取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)染色法、核酸蛋白測定儀測定蛋白濃度，制膠、電泳、半干法轉(zhuǎn)膜、加一抗、二抗孵育后，化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)對照；另取上清液做實時PCR擴(kuò)增定量分析，SIRT1引物上游序列5′-CAGTGTCATGGTTCCTTGC-3′、下游序列5′-CACCGAGGA ACTACCTGAT-3′，產(chǎn)物長度104 bp，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增，共40個循環(huán)，以U6為內(nèi)參。

1.2.5ColⅠ、ColⅡ及Col X表達(dá) 取術(shù)后第4、8及12周小鼠的軟骨組織切片，甲醇溶液孵育15 min，胰酶消化10 min、5%BSA封閉，加兔多克隆抗體ColⅠ、ColⅡ及Col X一抗，4℃過夜，加山羊抗兔IgG二抗(37 ℃、15 min)，加抗生蛋白鏈菌素-HRP孵育(37 ℃、10 min)，DAB顯色、蘇木精染色，脫水、封固，陰性對照組一抗以PBS代替。每個樣本取3個視野行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)改變、X線觀察及SIRT1水平

術(shù)后第4周的HE染色及X線片檢查結(jié)果顯示，正常組小鼠椎間盤纖維結(jié)構(gòu)清晰、層次分明，且呈同心圓的規(guī)整性排列、髓核內(nèi)可見髓核脊索細(xì)胞；模型組小鼠纖維環(huán)排列欠完整，可見輕度增生的軟骨細(xì)胞、膠原環(huán)出現(xiàn)排列紊亂、髓核細(xì)胞數(shù)目有所減少；試驗組小鼠椎間盤纖維環(huán)明顯紊亂，髓核細(xì)胞明顯減少；X線片結(jié)果顯示，正常組和試驗組小鼠頸椎和腰椎段生理前凸角度均較模型組大。Western Blot法檢測SIRT1圖像軟件灰度值分析結(jié)果及實時定量PCR結(jié)果顯示，試驗組小鼠軟骨組織的SIRT1水平顯著低于正常組和模型組(P<0.05)，模型組SIRT1水平顯著低于正常組(P<0.05)。詳見圖1～圖4。

注：A為正常組，B為模型組，C為試驗組。

注：A為正常組正位圖，B為正常組側(cè)位圖，C為模型組正位圖，D為模型組側(cè)位圖，E為試驗組正位圖，F(xiàn)為試驗組側(cè)位圖。

注：(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

注：(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

2.2 ColⅠ、ColⅡ及Col X表達(dá)

結(jié)果顯示，術(shù)后第8及12周時的3組小鼠椎間盤軟骨組織中Col Ⅰ、Col X水平高于術(shù)后第4周、Col Ⅱ低于術(shù)后第4周，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同時點比較，正常組各時點的Col Ⅰ、Col X均低于模型組和試驗組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，試驗組ColⅠ、ColX高于模型組， ColⅡ顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖5。

注:(1)示同時點與正常組比較，P<0.05；(2)示同時點與模型組比較，P<0.05；(3)示同組間與術(shù)后4周比較，P<0.05；(4)示與術(shù)后8周比較，P<0.05。

表1 各組小鼠不同時點椎間盤軟骨組織的ColⅠ、ColⅡ及Col X表達(dá)

3 討論

當(dāng)前尚未明晰椎間盤退變的具體發(fā)生機(jī)制，且也尚未有任何方法能夠完全逆轉(zhuǎn)椎間盤退變趨勢，導(dǎo)致椎間盤退行性疾病治療效果十分有限。從多方面探究椎間盤退變機(jī)制也是當(dāng)前學(xué)者們研究的重點。椎間盤由富有彈性的膠狀物組成的中央部髓核和中位呈同心圓排列的纖維環(huán)組成，是人體中最大的無血管組織。正常情況下的髓核細(xì)胞處于生理性低氧張力、酸性環(huán)境中，其營養(yǎng)供給來源于纖維環(huán)途徑和軟骨終板途徑[8-10]，且以后者為椎間盤最為重要的供給途徑。但當(dāng)軟骨終板細(xì)胞發(fā)生退變時，軟骨終板鈣化，降低椎間盤組織物質(zhì)代謝，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)聚集、水分減少、乳酸堆積并導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞死亡[11-12]；軟骨終板細(xì)胞退變也可通過影響腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)等炎性因子的水平而促進(jìn)椎間盤退變[13]：這些改變都能夠從膠原成分的動態(tài)改變加以分析。

ColⅠ是同心圓組織成分，負(fù)責(zé)椎間盤的抗力張強(qiáng)度(即吸收傳遞、牽拉變形等能力)，ColⅡ是反應(yīng)軟骨基質(zhì)的承受應(yīng)力(即吸收震蕩、彈性形變的能力)，ColX則為軟骨板提供了鈣化環(huán)境，ColⅠ升高、ColⅡ下降導(dǎo)致髓核應(yīng)力平衡被打破從而影響椎間盤的穩(wěn)定性[14-15]，且ColⅡ、ColX與基質(zhì)血管之間又可通過激活Ca+通道而促進(jìn)骨化[16-17]。可以說，ColⅠ、ColⅡ、ColX的動態(tài)變化可有效反應(yīng)椎間盤退行性程度。本研究選擇的 Col2-CreSIRT1co/co小鼠是一類含雌激素受體的配體結(jié)合區(qū)突變體(ERT)與Cre重組酶融合蛋白表達(dá)的小鼠，注射他莫昔芬后，其代謝產(chǎn)物與ERT相結(jié)合激活酶活性，從而達(dá)到SIRT1基因敲除的目的。目前，手術(shù)是建立椎間盤退變小鼠最常用的手段，與假手術(shù)的正常組比較，模型組小鼠膠原術(shù)后各時點的ColⅠ、ColX、ColⅡ均顯著變化，這提示模型組發(fā)生了椎間盤退行性改變；而試驗組與模型組相比，術(shù)后各時點的ColⅠ、ColX、ColⅡ均顯著變化，意味著試驗組不僅出現(xiàn)了椎間盤退行性改變，且這種病變進(jìn)程相較于模型組加快，同既往研究類似[7,14]。就正常組、模型組、試驗組3組小鼠的Western blot法檢查SIRT1的灰度值比較，試驗組的SIRT1表達(dá)下降，這提示，SIRT1參與了小鼠椎間盤退行性病變過程，且可能是SIRT1基因通過影響ColⅠ、ColX、ColⅡ的表達(dá)從而參與椎間盤退變。

髓核細(xì)胞數(shù)量減少是椎間盤退變最主要的病理表現(xiàn)之一，而細(xì)胞凋亡、老化都可導(dǎo)致髓核細(xì)胞活性喪失[18]。SIRT1是沉默信號調(diào)控因子(silence signal regulating factor 2，Sirt2)最為相似的同系物，能夠延緩多種細(xì)胞的衰老、凋亡，可作用于核細(xì)胞κB(nuclearfactor-κ B，NF-κB)、P53、FOXO發(fā)揮生物學(xué)功能[19-21]。SIRT1可對P53去乙?；种破浠钚远鴾p少P53所調(diào)控的細(xì)胞凋亡信號通路；SIRT1對NF-κB的影響機(jī)制較復(fù)雜[22-24]，目前認(rèn)為SIRT1可對細(xì)胞凋亡蛋白1抑制子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)的啟動子相結(jié)合而導(dǎo)致NF-κB信號通路未能激活；SIRT1還通過去乙?；苯?間接調(diào)控叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box，F(xiàn)OXO)活性而抑制細(xì)胞Fas(細(xì)胞凋亡基因)配體活性，以及通過FOXO延長細(xì)胞損傷DNA的自我修復(fù)時間從而提高其抗應(yīng)激能力[25]：SIRT1可能正是通過影響NF-κB、P53、FOXO一種或多種途徑調(diào)控髓核細(xì)胞衰老、凋亡。因此，在SIRT1基因被敲除后，調(diào)控髓核細(xì)胞衰老、凋亡能力減弱，從而導(dǎo)致病變進(jìn)程加快，而相比于模型組，其膠原成分變化更為明顯。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，敲除椎間盤模型小鼠的SIRT1基因會使小鼠軟骨組織中的ColⅠ、ColX水平升高和ColⅡ水平降低。但未就SIRT1基因影響的具體信號通路加以分析，未就SIRT1基因?qū)ψ甸g盤小細(xì)胞增殖、凋亡進(jìn)行研究；且在椎間盤中其炎癥反應(yīng)的劇烈程度也是導(dǎo)致退行性變化的重要因素之一，未就SIRT1基因是否對于TNF-α、IL-10等重要炎癥因子有相同的作用趨勢加以研究，這些都有待于后續(xù)研究。