梅瑤， 徐國(guó)波， 關(guān)煥玉， 廖尚高， 何迅， 席曉嵐

(貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴安新區(qū) 550025； 國(guó)家苗藥工程技術(shù)中心 & 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004)

白芨為蘭科植物白芨(Bletillastriata)的干燥塊莖，其味苦、甘、澀，性微寒，具有清熱利濕、收斂止血、消腫生肌之功效[1-3]，臨床上主要用于吐血、止血、外傷出血、瘡瘍腫毒以及皮膚皸裂等治療[3-5]。近幾年來，針對(duì)白芨多糖化學(xué)成分、藥理學(xué)、制劑學(xué)等方面進(jìn)行研究，董永喜等[6]發(fā)現(xiàn)白芨多糖(BSP)可通過升高血小板聚集率來調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)，發(fā)揮止血作用；武桂娟等[7]通過小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)BSP止血機(jī)制主要是增強(qiáng)血小板第Ⅲ因子活性、縮短凝血酶生成時(shí)間，形成人工血栓發(fā)揮止血作用。BSP中以白芨膠入藥時(shí)，可制成散劑、乳膏劑、涂膜劑片劑、膜劑、凝膠劑和口腔黏附片等[8-10]。白芨藥材中除了含有多糖組分外，還有較多非多糖物質(zhì)，如三萜類、聯(lián)菲類、二氫菲類、聯(lián)菲醚類、聯(lián)菲葡萄糖苷類以及菲并吡喃類等[11-13]。本課題在前期研究中，發(fā)現(xiàn)白芨非多糖組分也具有較好的止血藥效，可顯著縮短肝素化的小鼠凝血時(shí)間和出血時(shí)間，其止血機(jī)制與刺激血小板活化、增強(qiáng)血小板聚集、抑制纖維蛋白降解有關(guān)[14-17]；同時(shí)發(fā)現(xiàn)白芨非多糖組分中單體化合物4-hydroxymeth ylphenylβ-D-glucoside、白藜蘆苷(blestroside)、裸子苷Ⅰ (gymnoside Ⅰ)、裸子苷Ⅸ(gymnoside Ⅸ)和armatuside能顯著促進(jìn)血小板聚集作用。白芨苷、1-對(duì)羥基芐基-4-甲氧基菲-2,7-二醇(1-p-hydroxybenzyl-4-methoxyphenanthrene-2,7-diol)、α-異蘋果酸(α-isobutylmalic acid)、裸子苷Ⅰ (gymnoside Ⅰ)、裸子苷Ⅸ(gymnoside Ⅸ)和白藜蘆苷(blestroside)可顯著縮短肝素化小鼠的CT值[18]。除白芨非多糖組分藥理研究之外，其在制劑方面的研究未見報(bào)道，且臨床上使用的白芨藥品多為含白芨的中藥復(fù)方制劑，缺乏有關(guān)白芨止血有效組分(除多糖外)或有效成分的研究，嚴(yán)重制約了白芨產(chǎn)品的深度開發(fā)。因此，為了開發(fā)白芨相關(guān)制劑產(chǎn)品，本課題在前期研究基礎(chǔ)上，將白芨非多糖部分與輔料混合制成硬膠囊——止血精膠囊，并對(duì)止血精膠囊的質(zhì)量控制進(jìn)行研究，為其工藝生產(chǎn)和臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥材與主要試劑 藥材白芨(批號(hào)20180906，安龍縣欣蔓生物科技有限責(zé)任公司)由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與藥用植物學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為蘭科植物白芨Bletillastriata(Thunb.) Reichb. F.的干燥塊莖，藥用淀粉、糊精、微晶纖維素以及甘露醇(貴州欣紫鴻藥用輔料有限公司)，3號(hào)明膠空心膠囊(浙江省康奧健膠囊有限公司)、D101大孔樹脂(青島海洋化工有限公司)、95%食用酒精(批號(hào)180816，東新化工有限公司)、白芨苷對(duì)照品(批號(hào)DST-190219-100，成都德思特生物技術(shù)有限公司)，氯仿、乙酸乙酯為分析純，甲醇為色譜純，水為超純水。

1.1.2主要儀器 XB-HP中藥材粉碎機(jī)(山東臨清宏源制藥設(shè)備有限公司)、OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA，東京理化器械株式會(huì)社)、Aglient 1260高效液相色譜(HPLC，安捷倫科技有限公司)、AE 2401十萬級(jí)電子天平(梅特勒，托利多儀器上海有限公司)、KQ-250 DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、SC082768型純水機(jī)(四川沃特水設(shè)備有限公司)、DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、升降崩解儀(南京溫諾儀器有限公司)、DK-98-11電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)、DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、膠囊板(浙江省康奧健膠囊有限公司)。

1.2 方法

1.2.1止血精膠囊的提取工藝 白芨塊莖經(jīng)粉碎機(jī)打成粉末(過4號(hào)篩)，稱取白芨粉末6.5 kg，用4倍量95 %乙醇回流提取，2 h/次，提取3次；合并3次濾液后濃縮至浸膏，浸膏用水溶解后上大孔樹脂D101柱色譜(樹脂6 cm,75 cm)，經(jīng)水洗脫后，用80%乙醇溶液洗脫；收集并合并80%乙醇洗脫液，濃縮至稠膏，55 ℃真空干燥，制得止血精膠囊內(nèi)容物，提取率為2.6%。

1.2.2止血精膠囊的制備工藝 稱取白芨非多糖浸膏粉(過60目篩)與稀釋劑微晶纖維素按1 ∶1混勻，加入一定量的75%乙醇作為潤(rùn)濕劑(噴灑加入、少量多次)制軟材直至“手握成團(tuán)、觸之即散”；過20目篩擠壓制粒，將濕顆粒于60 ℃下干燥，取干燥好的顆粒整粒，過40～80目篩，去除細(xì)粉，即得粒度40～80目的膠囊填充物，裝入3號(hào)空心膠囊，即得止血精膠囊。

1.2.3止血精膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 (1)依照《中國(guó)藥典》2015 年版四部通則0103 膠囊劑[19]，檢查膠囊水分、裝量差異和崩解時(shí)限;(2)薄層鑒別：稱取3批膠囊內(nèi)容物40 mg研細(xì)，加入甲醇10 mL，超聲30 min后過濾，獲得供試品溶液。取白芨苷對(duì)照品適量，加甲醇超聲溶解后制成濃度為1 g/L的對(duì)照品溶液。以空白輔料的甲醇溶液作為陰性對(duì)照溶液，選擇氯仿 ∶乙酸乙酯 ∶甲醇 ∶水=4 ∶3 ∶3 ∶0.25為展開劑，顯色劑為10%硫酸乙醇溶液；吸取配制好的上述溶液分別點(diǎn)樣于同一硅膠板上，放置于層析缸中展開，取出晾干，噴上顯色劑后，于電爐上方105 ℃烘烤加熱至顯色清晰。

1.2.4白芨苷含量的測(cè)定 (1)色譜條件 ：Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×150 nm×5 μm)，保護(hù)柱為Phenomenex Security Guard C18，柱溫40 ℃，流動(dòng)相為甲醇 ∶水(40 ∶60)，檢測(cè)波長(zhǎng)為223 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL；理論塔板數(shù)以白芨苷計(jì)數(shù)應(yīng)不低于5 000，白芨苷與其它色譜峰分離度>1.5，對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性樣品溶液色譜圖見圖1;(2)對(duì)照品溶液的制備：稱取白芨苷標(biāo)準(zhǔn)品5.09 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解定容后，制成濃度為0.509 g/L的儲(chǔ)備溶液，搖勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?(3)供試品溶液的制備：稱取膠囊內(nèi)容物0.2 g，置于圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流處理2 h，冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾。量取續(xù)濾液5 mL轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得;(4)陰性樣品溶液的制備：按照止血精膠囊處方比例及制備工藝，制成缺白芨非多糖組分的陰性樣品溶液，按“(3)”方法處理，即得。

注：A為白芨苷對(duì)照品溶液，B為供試品溶液，C為陰性樣品溶液。

2 結(jié)果

2.1 性狀

膠囊劑每粒間無黏結(jié)，外觀干凈整潔、沒有滲漏和囊殼破裂，膠囊內(nèi)容物均為黃棕色顆粒、沒有結(jié)塊現(xiàn)象，味微苦、無異味。

2.2 薄層鑒別

供試品溶液與對(duì)照品溶液在對(duì)應(yīng)位置上均顯示相同顏色的斑點(diǎn)，且輔料對(duì)其無干擾。見圖2。

注：1為對(duì)照品溶液，2、3、4為不同批次供試品溶液，5為陰性對(duì)照溶液。

2.3 水分、裝量差異和崩解時(shí)限

3批樣品(S1、S2和S3)含水量均<9.0%。裝量差異中取3批止血精膠囊各10粒，進(jìn)行檢查，由表1可知，3批膠囊劑裝量差異均在±10%內(nèi)，符合規(guī)定。依據(jù)《中國(guó)藥典》2015 年版四部通則0921崩解時(shí)限檢查法，3批止血精膠囊均在30 min內(nèi)崩解，符合藥典對(duì)硬膠囊劑崩解時(shí)限的要求。

表1 3批膠囊(每批10粒)裝量差異結(jié)果

2.4 白芨苷的含量測(cè)定

2.4.1線性關(guān)系考察 精密量取“1.2.4(2)”項(xiàng)下制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液2.0、1.6、1.0、0.8、0.5和0.25 mL，分別置于25 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，混勻，制得濃度為40.72、32.58、20.36、16.29、10.18和5.09 mg/L的系列對(duì)照品溶液。按“1.2.4(1)”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸。白芨苷回歸方程：Y=13 933X+24.413(r=0.999 9)，表明白芨苷檢測(cè)濃度線性范圍為5.09～40.72 mg/L，在上述濃度范圍內(nèi)，白芨苷峰面積與對(duì)應(yīng)濃度線性關(guān)系良好。

2.4.2精密度試驗(yàn) 取“1.2.4(3)”項(xiàng)下供試品溶液(編號(hào)S6)，按照“1.2.4(1)”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定白芨苷峰面積，計(jì)算得到白芨苷峰面積的RSD為0.23%，表明儀器精密度良好。

2.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品S6共6份，每份約0.2 g，按“1.2.4(3)”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.4(1)”項(xiàng)色譜條件，于223 nm波長(zhǎng)下測(cè)定峰面積按照外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，測(cè)定6份樣品含量的RSD。計(jì)算得到白芨苷的平均含量為26.27 mg/g，RSD為0.33%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的樣品(編號(hào)S6)9份(每份約0.1 g)，按樣品中白芨苷本底含量加入50%(3份)、100%(3份)、150%(3份)質(zhì)量的對(duì)照品，按照“1.2.4(3)”項(xiàng)下方法制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的加樣回收樣品溶液，在“1.2.4(1)”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD。由表2結(jié)果計(jì)算得出白芨苷的加樣回收率平均值為100.48%，RSD為2.52%。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液S6，分別于室溫下放置0、2、4、8、16 h按照“1.2.4(1)”項(xiàng)色譜條件下，于223 nm波長(zhǎng)下測(cè)定白芨苷峰面積，經(jīng)計(jì)算白芨苷峰面積RSD為0.38%，表明供試品溶液在室溫條件下16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6樣品含量測(cè)定 分別取10批止血精膠囊膠囊樣品，按“1.2.4(3)”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.4(1)”項(xiàng)下色譜條件下，于223 nm波長(zhǎng)下測(cè)定白芨苷峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算膠囊中白芨苷的含量，每份樣品測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果見表3。

表3 白芨苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

白芨具有很重要的臨床藥用價(jià)值，特別是在止血方面，前期已經(jīng)證明其主要成分非多糖表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，故本研究在前期基礎(chǔ)上將白芨非多糖部分制備為膠囊劑，結(jié)果表明制備工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控，也提高了藥物穩(wěn)定性。

通過粉體學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)白芨非多糖浸膏粉極易吸潮，直接罐裝會(huì)影響其質(zhì)量，故進(jìn)行了輔料和潤(rùn)濕劑的考察，而輔料的篩選、用量是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵所在。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)[20-21]，進(jìn)行了輔料用量和種類的考察，先后考察了淀粉、糊精、甘露醇和微晶纖維素，浸膏粉與不同輔料混勻后，其吸濕性和流動(dòng)性均降低。其中，以微晶纖維素為輔料時(shí)，休止角為30.28 ℃，小于選用其余3種輔料時(shí)的休止角；且在濕度環(huán)境為75 %下，12 h后，仍呈粉末狀(吸濕率為11.13 %，均小于其余3種輔料)，故選擇微晶纖維素作為輔料制備膠囊劑?？疾炝瞬煌壤乃幏叟c微晶纖維素混合(10 ∶1、5 ∶1和1 ∶1)，發(fā)現(xiàn)藥粉與微晶纖維素為1 ∶1混合時(shí)，休止角最小，浸膏粉的流動(dòng)性得到了改善，吸濕性最低。

有研究表明，乙醇的濃度與用量對(duì)顆粒劑的成型具有直接的影響[22]，故進(jìn)行了乙醇濃度的考察，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度為75%時(shí)，黏性適中、不起團(tuán)、易過篩，制成的顆粒收率達(dá)到了80 %，且流動(dòng)性和吸濕性均符合膠囊劑的要求。

結(jié)合白芨非多糖提取率及白芨臨床用量，表明止血精多糖膠囊每天的服用劑量為0.78 g，若每天服用3次，每次2粒，則每粒膠囊質(zhì)量為0.13 g(含生藥量2.5 g),則所需膠囊體積為0.28 mL,而3號(hào)膠囊體積為0.3 mL,故用3號(hào)膠囊灌裝。

本實(shí)驗(yàn)在對(duì)TLC條件進(jìn)行篩選時(shí)，考察了氯仿:乙酸乙酯 ∶甲醇 ∶水、氯仿 ∶甲酸 ∶甲醇以及正丁醇 ∶乙酸乙酯 ∶水體系，發(fā)現(xiàn)后兩者萃取得到的色譜圖均出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，且分離時(shí)間長(zhǎng)。而前者分離度良好，得到的色譜圖斑點(diǎn)清晰分明，且重現(xiàn)性好。故最終確定展開劑為氯仿 ∶乙酸乙酯 ∶甲醇 ∶水(4 ∶3 ∶3 ∶0.25)。

研究表明，白芨非多糖中的主要成分為白芨苷[18,23]。因此采用HPLC控制白芨苷的含有量，在進(jìn)行檢測(cè)波長(zhǎng)的確定時(shí)，通過采用二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)白芨苷在200～400 nm處進(jìn)行紫外吸收全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)白芨苷在223 nm檢測(cè)波長(zhǎng)條件下基線平穩(wěn)，色譜豐度較好；在進(jìn)行柱溫考察時(shí)，通過考察色譜柱溫在25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃時(shí)的分離效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)柱溫為30 ℃時(shí)，白芨苷以及各樣品溶液分離效果最佳。HPLC法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性良好，可用于白芨非多糖止血精膠囊的質(zhì)量控制。