曾經(jīng)章， 楊勤， 謝汝佳， 陸爽， 趙雪珂， 李璨

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 病理生理學教研室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 感染科， 貴州 貴陽 550004)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)作為對人類健康有著致命性危害的惡性腫瘤之一，其在全世界范圍內(nèi)占據(jù)著高居第2位及第5位的惡性腫瘤死亡率與發(fā)病率[1-2]。HCC起病隱匿，大部分患者在確診時已是晚期，5年生存率低于5%[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是蛋白質(zhì)合成、分泌及折疊等活動的重要場所，也是細胞內(nèi)Ca2+存儲和脂質(zhì)合成的重要場所[4]。作為ER上跨膜蛋白的雙鏈RNA依賴蛋白激酶樣ER激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulokinase，PERK)在正常狀態(tài)下和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78(glucose regulated protein 78，GRP78)進行結(jié)合，當氧化應激和過多蛋白質(zhì)合成時，ER的平衡狀態(tài)被破壞，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的發(fā)生，細胞ER中大量的未折疊蛋白聚集且與GRP78發(fā)生競爭性的結(jié)合，造成PERK與GRP78的解離，發(fā)生磷酸化及二聚化活化，進而激活磷酸化PERK(p-PERK)等下游因子進行一系列反應，促進細胞對ERS的適應[5]。ERS是細胞重要的適應代償機制，與腫瘤關(guān)系密切，可以通過促進腫瘤血管生成、促進腫瘤細胞休眠及降低腫瘤細胞對某些化學藥物的敏感性等發(fā)揮促癌作用[6-10]，但ERS在HCC發(fā)展過程中促生存機制還有待確定。因此，本研究通過免疫組織化學定性和Western blot半定量檢測，從蛋白水平分析ERS中的重要蛋白GRP78和p-PERK在癌旁及不同分化程度HCC組織中的表達，探索GRP78和p-PERK在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其與HCC臨床病理特征間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源 收集2017年1月—2018年12月手術(shù)切除的HCC患者組織標本40例作為HCC組，取同一患者的癌旁組織標本40例作為癌旁組。所有患者均為已確診的原發(fā)性HCC，且手術(shù)前均未進行放化療，臨床資料齊全；男27例、女13例，年齡<50歲18例、≥50歲22例，腫瘤直徑<3 cm 15例、≥3 cm 25例，高、中及低分化型癌(與edmondson-steiner分級標準的Ⅰ級、Ⅱ～Ⅲ級及Ⅳ級對應)分別為12、15及13例(即高、中、低分化組)；所有組織標本都在手術(shù)切除之后馬上采集，采集時需要避開出血區(qū)及壞死的組織，并按照1 cm×1 cm×1 cm分割標本，用于免疫組織化學檢測的標本固定于中性福爾馬林溶液中，用于Western blot檢測的標本保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2主要試劑與儀器 GRP78和PERK抗體(英國Abcam)，p-PERK抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(美國Cell signaling technology)，蘇木素伊紅( hematoxylin-eosin staining，HE)染色試劑盒、封閉用山羊血清(原液)及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE )凝膠制備試劑盒(北京Solarbio)，兔二步法試劑盒和辣根過氧化物酶(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋)；5S-3D脫色搖床(海門市其林貝爾公司，ChemiScope5300一體式化學發(fā)光成像系統(tǒng)和凝膠成像儀(上海勤翔)，-80 ℃冰箱(海爾電器)，水浴箱(金壇科析)，Synergy H4型酶標儀(美國伯騰)。

1.2 方法

1.2.1HE染色 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗滌組織標本2次，10%中性福爾馬林溶液固定24 h，梯度脫水后石蠟包埋，切成2～5 μm薄片；二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，行HE染液染色5 min，蒸餾水沖洗；透明結(jié)束后切片置于通風櫥，載玻片上組織邊緣加中性樹膠1滴，蓋玻片與載玻片之間呈45 °斜放封固組織切片，鏡下觀察，由2名病理醫(yī)師雙盲法判定結(jié)果，采集圖片。

1.2.2免疫組織化學染色及結(jié)果判斷 取組織標本采用檸檬酸抗原修復10 min，3%H2O2室溫孵育20 min，山羊血清封閉20 min，一抗PERK和GRP78滴加處理、50 μL/片，4 ℃孵育過夜；滴加二抗50 μL/片，室溫孵育60 min，DAB顯色，梯度酒精脫水、中性樹膠封片。顯微鏡下隨機選取5個高倍鏡視野觀察定位，在細胞質(zhì)中觀察到棕黃色顆粒則為GRP78、PERK陽性細胞。染色計分標準[11]：按400×的放大倍數(shù)，各視野中觀察100個細胞并進行統(tǒng)計以評分，陽性染色細胞數(shù)量超過50%、25%～49%、低于25%及沒有出現(xiàn)染色分別計為3、2、1及0分，若陽性染色細胞呈棕黃色、黃色及淡黃色分別計3、2及1分，以陽性細胞及染色的評分乘積作為最終得分；最終得分為0～1、2～3 、4～6 及7～9分計為陰性(-)、弱陽性(+)、陽性(++)及強陽性(+++)，前2項為陰性，后2項為陽性。

1.2.3Western blot檢測 取組織標本50 mg，加RIPA裂解液提取總蛋白，使用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度；取50 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜；分別加GRP78、PERK及p-PERK抗體(濃度均為1 ∶500)，4 ℃孵育過夜；次日經(jīng)TBST緩沖液洗膜后加辣根過氧化物酶 (horseradish peroxidase，HRP) 標記的二抗(濃度1 ∶2 000)，室溫孵育1 h洗膜，化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)法顯色。選取GAPDH作為內(nèi)參照，用凝膠分析軟件對圖像進行分析，測定蛋白灰度值，以GAPDH及其相應總蛋白計算各蛋白的相對表達量。

1.2.4臨床病理特征資料 收集所有患者的臨床資料和術(shù)后病理資料，包括年齡、性別、術(shù)前甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平、腫瘤大小及病理分化類型(高分化、中分化和低分化)。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理，等級計數(shù)資料采用率(%)表示，率的比較采用χ2檢驗，采用Pearson法對GRP78和p-PERK蛋白的陽性表達進行相關(guān)性分析，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學

光鏡下可見癌旁組細胞形態(tài)正常，排列緊密且規(guī)律，細胞組織結(jié)構(gòu)完整、清晰；高分化組HCC細胞呈多角形、胞漿豐富、顆粒狀、嗜伊紅，胞核較大、核膜厚、染色質(zhì)多集中于核膜周圍、核仁大而明顯；中分化組HCC細胞介于高、低分化HCC細胞，形態(tài)多樣，胞漿稍豐富，胞核大。低分化組HCC細胞明顯異形、胞漿較少，胞核明顯增大、深染、核漿比例增高、可見核膜反褶，胞漿內(nèi)含、伊紅染色的核內(nèi)包涵體，并可見核分裂相和瘤巨細胞，癌細胞可排列呈梁狀、腺樣，腫瘤間質(zhì)一般稀少。見圖1。

注：A為癌旁組，B為高分化HCC組，C為中分化HCC組，D為低分化HCC組。

2.2 免疫組織化學染色

HCC組標本可見GRP78和p-PERK蛋白的陽性染色主要位于細胞胞質(zhì)內(nèi)，低分化組標本胞質(zhì)可見大量呈彌漫點狀棕黃色顆粒染色，高分化組標本胞質(zhì)中可見呈淺棕黃的顆粒染色，中分化組標本胞質(zhì)中的陽性染色率和顆粒染色顏色介于高、低分化組之間，癌旁組標本胞質(zhì)內(nèi)幾乎未見陽性染色顆粒；與癌旁組相比，高、中、低分化組標本GRP78和p-PERK陽性細胞得分均增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；比較不同分化組可見，GPR78及p-PERK陽性細胞得分隨分化程度的降低而增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A～H為DAB染色結(jié)果(免疫組織化學，×400)，A、E為癌旁組，B、F為高分化HCC組，C、G為中分化HCC組，D、H為低分化組，I、J分別為GRP78和p-PERK陽性表達得分，箭頭表示陽性細胞；(1)與癌旁組比較，P<0.05；(2)與高分化組比較，P<0.05；(3)與中分化組比較，P<0.05。

2.3 Western blot結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，高、中及低分化組標本中GRP78蛋白表達水平高于癌旁組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且GRP78蛋白的表達量隨著HCC分化程度的降低而增加，以低分化HCC組為最高(P<0.05)；高、中及低分化HCC組標本p-PERK蛋白的表達水平分別高于癌旁組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且p-PERK蛋白表達隨著HCC分化程度降低而增高，以低分化HCC組最高(P<0.05)。見圖3。

注：A為Western blot電泳條帶，B、C分別為GRP78和p-PERK蛋白表達定量結(jié)果；(1)與癌旁組比較，P<0.05；(2)與高分化組比較，P<0.05；(3)與中分化組比較，P<0.05。

2.4 GRP78、p-PERK蛋白的陽性表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

HCC組標本GRP78、p-PERK蛋白的陽性表達與患者臨床病理特征的關(guān)系進行分析，結(jié)果顯示，GRP78、p-PERK蛋白的陽性表達與患者年齡、性別無關(guān)(P>0.05)，GRP78蛋白陽性表達與患者術(shù)前AFP水平、腫瘤大小、腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)，p-PERK蛋白的陽性表達與腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)、與術(shù)前AFP水平和腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 HCC組織GRP78、p-PERK的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.5 HCC組織GRP78、p-PERK蛋白表達的相關(guān)性

結(jié)果顯示，GRP78和p-PERK蛋白表達之間呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(r=0.482，P=0.012)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)HCC同其他常見惡性腫瘤一樣，因其腫瘤細胞過快生長增加糖的分解，其肝癌細胞主要為高糖代謝[12]。由于腫瘤生長速度過快而引起供血不足，使其腫瘤微環(huán)境具有嚴重低氧、酸中毒及環(huán)境葡萄糖的耗竭等相關(guān)特征[13]。此種微環(huán)境是導致ERS和引發(fā)未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)發(fā)生的最可能因素之一，UPR則對于促進應激細胞的功能恢復能夠起到積極的影響，而其中GRP78高表達被認為是ERS激活的標志[14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，GRP78蛋白表達水平升高具有以下影響[15-16]：(1)ERS使錯誤蛋白及未折疊蛋白的正常構(gòu)像得以有效的恢復，因而細胞在應激狀態(tài)下其蛋白質(zhì)可正確地合成；(2)調(diào)節(jié)Ca2+平衡，即Ca2+在ER膜以肌醇三磷酸通路的激活而被陸續(xù)釋放至胞質(zhì)，使胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之中Ca2+保持平衡，同時還使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+對氧化應激有對抗，這將使ERS得以減輕，而且也防止了細胞凋亡的產(chǎn)生；(3)它對ERS誘導的凋亡反應通路有促進作用。國內(nèi)研究表明，與正常肝組織及肝硬化組織相比，肝癌組織GRP78蛋白表達水平明顯更高[17-18]。本研究中，GRP78蛋白在HCC組織中表達，高分化組中GRP78蛋白表達最低，低分化組中表達最高，其表達與HCC的分化程度相關(guān)，與上述研究結(jié)論一致，因此可以推測GRP78參與了HCC的發(fā)生發(fā)展過程，即隨著HCC惡性程度的增高，腫瘤細胞出現(xiàn)的嚴重低氧、酸中毒及環(huán)境葡萄糖的耗竭等微環(huán)境惡化越加明顯，腫瘤細胞為了維持自身的生存，激活了UPR的保護性機制，而這種機制可能與促進HCC生存及發(fā)展有關(guān)。

大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的生存與發(fā)展與腫瘤新生血管生成有關(guān)[19-20]。ERS中PERK-eIF2α通路與新生血管形成關(guān)系密切，腫瘤細胞在缺氧條件下主要通過誘導缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor lα，HIFlα)上調(diào)血管生成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，促進新生血管的形成[21]。其中，血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的、促進新生血管形成的最主要的調(diào)節(jié)因子。如Wang等[22]研究實驗表明，PERK-eIF2α-ATF4通路可以直接作用于VEGF的啟動子，上調(diào)VEGF的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)血管生成抑制因子，促進新生血管的產(chǎn)生；胰島素瘤模型也證明，PERK是腫瘤血管生成的必要條件，敲除PERK基因減少了血管的生成，相關(guān)的小鼠胚胎成纖維細胞中也證明了上述觀點[23-26]。由此可以認為，腫瘤分化程度越低，細胞缺血缺氧微環(huán)境越需要新生血管生成，腫瘤組織血液供應則越豐富，而PERK-eIF2α通路則需要上調(diào)表達，而PERK 屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 PERK-elF2α 信號轉(zhuǎn)導通路的啟動蛋白，并被胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域的自身二聚化和磷酸化激活[27]，由此可以解釋磷酸化PERK表達與腫瘤的分化程度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，高、中、低分化組中p-PERK蛋白的表達均高于癌旁組，且HCC分化程度越低，p-PERK蛋白表達越高，由此推測PERK通路參與HCC的發(fā)生發(fā)展，p-PERK蛋白表達水平越高，可能造成了新生血管的形成增加，導致了HCC的分化程度也就越低。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，HCC組織中GRP78和p-PERK蛋白的表達率與患者年齡、性別無關(guān)，GRP78蛋白表達與術(shù)前AFP水平、腫瘤大小、HCC分化程度均相關(guān)；p-PERK蛋白的表達率與肝癌的分化程度有關(guān)，進一步研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中GRP78、p-PERK蛋白的表達之間互相呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，GRP78、p-PERK蛋白可能成為臨床檢測HCC及判斷預后的腫瘤標志物。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白GRP78、p-PERK可能與HCC的分化程度和侵襲能力的增強有著密不可分的關(guān)系，即GRP78過表達表明ERS參與了HCC的發(fā)生發(fā)展過程，而p-PERK的高表達則考慮UPR中PERK-eIF2α通路發(fā)揮了作用，可能機制為上調(diào)VEGF，促進腫瘤新生血管生成，使腫瘤細胞適應嚴重低氧、酸中毒、環(huán)境葡萄糖的耗竭等微環(huán)境惡化，可能促進HCC發(fā)展有關(guān)。但本研究實驗數(shù)據(jù)較少，并且缺乏mRNA水平方面研究，后期需加大樣本量并開展mRNA水平研究，繼續(xù)探究GRP78及PERK信號通路在HCC發(fā)生發(fā)展中可能存在的機理。