張蕾 張航

摘要 [目的]對(duì)白玉菇酸性磷酸酯酶進(jìn)行分離純化，并研究其酶學(xué)性質(zhì)。[方法]以白玉菇為材料提取酸性磷酸酯酶（ACPase，EC.3.1.3.2），進(jìn)一步將原酶液鹽析、層析2種常用的蛋白純化技術(shù)，分離得到酸性磷酸酯酶，并對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。[結(jié)果]該酶分子量約為70 kD，水解對(duì)硝基苯磷酸二鈉（pNPP）最適pH為4.5，等電點(diǎn)為5.5，最適溫度為40 ℃，該酶在50 ℃時(shí)有熱激活效應(yīng);紫外吸收光譜測(cè)定結(jié)果表明，酶有2個(gè)吸收峰，分別在220和280 nm處;耐熱時(shí)間表明在40 ℃下耐熱保溫40 min后，酶活力為最大活力的60.79%，并在保溫20 min時(shí)酶活力最大，50 ℃時(shí)酶活力隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，保溫20 min后，酶活力下降為最初酶活力的20.77%;Hg2+、Pb2+、Ag+、Cd2+ 4種金屬離子對(duì)酶活性均有抑制作用，Ag+抑制作用最強(qiáng)。酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為0.031 mmol/L、Vmax為0.204 mmol/（L·min）、酶反應(yīng)初速度為18.66×10-3 μmol/L。[結(jié)論] 酸性磷酸酯酶的活性受溫度、pH、金屬離子等外界條件的影響，因此在栽培過(guò)程中需要控制環(huán)境溫度及培養(yǎng)基酸堿度等條件。

關(guān)鍵詞 白玉菇;酸性磷酸酯酶;分離純化;動(dòng)力學(xué)特性;酶活性

中圖分類(lèi)號(hào) Q814? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）10-0004-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.002

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Separation and Purification of Acid Phosphatese and Enzymic Properties of White Hypsizygus marmoreus

ZHANG Lei1，ZHANG Hang2 （1.Xuhui High School，Shanghai 200030;2.Shanghai Hongqiao International Airport Company，Shanghai 200230）

Abstract [Objective]? To isolate and purify the acid phosphatase from white Hypsizygus marmoreus and study its enzymatic properties.[Method] The acid phosphatase （ACPase，EC.3.1.3.2） was extracted from white Hypsizygus marmoreus as the material，and the original enzyme solution was further salted out and chromatographed through two commonly used protein purification techniques to isolate the acid phosphatase，and the enzymatic properties of the enzyme were studied.[Result] The molecular mass of the enzyme was 70 kD，the optimum pH of ACPase was 4.5 when pNPP was used as substrate，isoelectric point was 5.5，and the optimum temperature was 40 ℃，and could be activated at 50 ℃.The results of UV absorption spectroscopy showed that the enzyme had two absorption peaks at 220 and 280 nm respectively.The heat-resisting time showed that after heat-resisting at 40 ℃ for 40 min，the enzyme activity was 60.79% of the maximum activity，and the enzyme activity was the largest at 20 min.At 50 ℃，the enzyme activity decreased with the extension of the incubation time.After 20 minutes of incubation，the enzyme activity decreased to 20.77% of the original enzyme activity.The four metal ions of Hg2+，Pb2+，Ag+，Cd2+ had inhibitory effects on enzyme activity，and Ag+ had the strongest inhibitory effect.The enzyme kinetic parameters Km was 0.031 mmol/L，Vmax was 0.204 mmol/（L·min），and the initial reaction rate of the enzyme was 18.66×10-3 μmol/L.[Conclusion]? The activity of acid phosphatase is affected by external conditions such as temperature，pH，metal ions，etc.Therefore，it is necessary to control the environment temperature and the pH of the medium during the cultivation process.

Key words White Hypsizygus marmoreus;ACPase;Separation and purification;Kinetic characteristics; Enzyme activity

白玉菇（white Hypsizygus marmoreus）屬于傘菌目、口蘑科、白蘑屬，是一種珍稀食用菌，富含有多種維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)常食用能夠改善人體的新陳代謝，降低膽固醇[1-2]。白玉菇在我國(guó)已經(jīng)得到了廣泛栽培。酸性磷酸酯酶（ACPase）廣泛分布于動(dòng)物和植物中，是生物磷代謝的重要酶類(lèi)，除了參與磷脂的代謝外，還參與代謝調(diào)節(jié)、能量轉(zhuǎn)化等重要生命活動(dòng)[3]。ACPase參與植物的磷代謝，在細(xì)胞調(diào)節(jié)過(guò)程中起著重要的作用[4]。白玉菇的生長(zhǎng)環(huán)境尤其是環(huán)境中的金屬離子可導(dǎo)致酶活力的變化，進(jìn)而影響白玉菇的生長(zhǎng)發(fā)育。目前國(guó)內(nèi)對(duì)白玉菇活性物質(zhì)研究主要集中于多糖的研究，對(duì)ACPase的研究鮮有報(bào)道[5-7]。該試驗(yàn)以白玉菇為試驗(yàn)材料，分離純化ACPase，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為白玉菇的栽培提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 酸性磷酸酯酶的制備 將白玉菇稱(chēng)重后，按1∶2.0（W∶V）加入預(yù)冷的20 mmol/L pH 5.0 NaAc-HAc緩沖液于勻漿機(jī)中充分破碎，然后將勻漿液過(guò)濾，再將過(guò)濾后的濾液離心（10 000 r/min，20 min，4 ℃）得到的上清液即為粗酶液。取上清加入固體硫酸銨至飽和度為40%，4 ℃，靜止30 min，離心（10 000 r/min，20 min，4 ℃），棄沉淀。收集上清液加硫酸銨至飽和度為60%，離心（10 000 r/min，20 min，4 ℃）棄上清，收集沉淀。用20 mmol/L pH 5.0 NaAc-HAc緩沖液懸浮沉淀，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，去除未溶解的部分蛋白，留取上清。去除雜蛋白后的酶液用超濾濃縮的方法濃縮到少量體積后再利用SephadexG-200柱（1.0 cm×100 cm）層析純化，20 mmol/L pH 5.0 NaAc-HAc緩沖液洗脫，流速0.5 mL/min。每管收集2 mL，合并有酶活的部分。

純化后的樣品采用SDS-PAGE凝膠電泳方法進(jìn)行酶蛋白純度分析和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。分離膠質(zhì)量濃度為10%，濃縮膠質(zhì)量濃度為3%。

1.2 酶學(xué)特性

1.2.1 酶活力的測(cè)定。參照楊立紅等[8-9]方法，酶活力測(cè)定反應(yīng)總體積為5 mL含3 mL 20 mmol/L pH 5.0 NaAc-HAc 緩沖液、1 mL 10 mmol/L MgSO4和1 mL 5 mmol/L的底物對(duì)硝基苯磷酸二鈉（PNPP），在37 ℃下，預(yù)熱5 min，加100 μL酶液，反應(yīng)10 min，加2.5 mL 200 mmol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，以去離子水代替酶液作為對(duì)照。

1.2.2 酶的最適pH、最適溫度的測(cè)定。酶活力反應(yīng)體系同“1.2.1”，pH 3.5～ 6.0，室溫下測(cè)定酶活力。 最適溫度測(cè)定同最適pH測(cè)定方法，設(shè)置7個(gè)溫度，分別為30、35、40、45、50、55、60 ℃。

1.2.3 酶等電點(diǎn)（pI）的測(cè)定。該試驗(yàn)在測(cè)定酶的等電點(diǎn)時(shí)，從pH 3.0～6.0每間隔0.5個(gè)數(shù)值設(shè)置7個(gè)pH，以便了解等電點(diǎn)的大致范圍。分別取不同pH酶反應(yīng)緩沖體系5 mL，加100 μL酶液，測(cè)波長(zhǎng)280 nm下的吸光度，吸光度最大時(shí)沉淀最多，該pH即為酶的等電點(diǎn)。

1.2.4 酶促反應(yīng)初速度、米氏常數(shù)的測(cè)定。

在“1.2.1”活力測(cè)定體系中，在2、4、6、8、10、15、20、25、30 min分別測(cè)定反應(yīng)速度，以反應(yīng)產(chǎn)物濃度對(duì)時(shí)間作圖，可得出反應(yīng)初速度。改變底物濃度（5～30 mmol/L），按照l(shuí)ineweaver-Burk作圖法進(jìn)行計(jì)算，得出米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。

1.2.5 酶的紫外吸收光譜的測(cè)定。取適量酶液，于200～320 nm 處測(cè)吸光度，繪出紫外吸光圖譜。

1.2.6 重金屬離子對(duì)ACPase活力的影響。

參照楊立紅等[8]方法，在4 mL反應(yīng)體系中，加入3 mL 20 mmol/L pH 5.0的HAc-NaAc 緩沖液、1 mL 5 mmol/L 的 PNPP 溶液，再分別加入重金屬離子Hg2+、Pb2+、Ag+和Cd2+的鹽溶液，使金屬離子終濃度分別為0、50、100、200、300、400、500 μmol/L，于37 ℃恒溫水浴中預(yù)熱5 min 后，加入100 μL 酶液，37 ℃反應(yīng)10 min 后加入2.5 mL 200 mmol/L 的 NaOH 溶液終止反應(yīng)，測(cè)定420 nm 處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACPase的分離純化

將勻漿、鹽析后的粗酶液上樣于Sephadex G-200層析柱，如圖1所示在第12管時(shí)出現(xiàn)酶活力峰，第15管后酶的活力顯著降低。合并12～15管洗脫液，合并濃縮后SDS-PAGE純度檢測(cè)及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果如圖2，利用Quantity one軟件進(jìn)行蛋白純度分析，純度約為95%。與蛋白Marker比對(duì)，分子量約為70 kD，這與楊立紅等[10]純化的大致相當(dāng)。

2.2 酶學(xué)特性

2.2.1 酶的最適pH、最適溫度及耐熱性的測(cè)定。圖3a表明ACPase的最適pH為4.5，在最適pH條件下，測(cè)定不同溫度下ACPase的活性，圖3b顯示ACPase的最適溫度為40 ℃;當(dāng)溫度上升至50 ℃時(shí)，酶的活性均再次升高，推測(cè)該酶有熱激活現(xiàn)象。

酶在最適溫度下孵育35 min，20 min時(shí)活性最大（圖4a），50 ℃保溫20 min，酶活性顯著下降，保溫20 min時(shí)活力下降為最大活力的20.77%（圖4b）。

2.2.2 酶促反應(yīng)初速度、米氏常數(shù)的測(cè)定。由圖5計(jì)算出酶反應(yīng)初速度為0.186 6 μmoL/min?；趌ineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線(xiàn)，以對(duì)硝基苯磷酸二鈉（PNPP）為反應(yīng)底物，分別對(duì)ACPase的米氏常數(shù)Km 和最大反應(yīng)速度Vmax進(jìn)行分析，如圖6所示，ACPase的Km值和Vmax的值分別為0.031 mmol/L和0.204 mmol/（L·min）。

2.2.3 酶的等電點(diǎn)測(cè)定。從白玉菇ACPase等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果（圖7）可以看出，在pH 5.5時(shí)ACPase的吸光度達(dá)到最大值，因此得出白玉菇ACPase等電點(diǎn)為5.5。

2.2.4 酶的紫外吸收光譜的測(cè)定。從白玉菇ACPase的紫外吸收光譜測(cè)定結(jié)果（圖8）可以看出，白玉菇ACPase的紫外吸收峰在220和280 nm波長(zhǎng)處，與蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜相符。

2.2.5 重金屬離子對(duì)酶活力的影響。重金屬離子對(duì)ACPase影響結(jié)果如圖9所示，該試驗(yàn)所驗(yàn)證的重金屬離子中，Ag+對(duì)酶活性的影響有明顯的抑制作用，濃度為100 μmol/L時(shí)，相對(duì)酶活性為36.33%;Hg2+、Pb2+和Cd2+對(duì)酶活性的影響也均有抑制作用，其中Pb2+的抑制作用最弱。這與其他來(lái)源的ACPase試驗(yàn)結(jié)果有所不同，楊立紅等[8]對(duì)刺身ACPase的研究發(fā)現(xiàn)，Hg2+ 對(duì)酶的活性抑制作用最強(qiáng)，其次為Ag+。進(jìn)一步表明不同來(lái)源的ACPase的酶學(xué)性質(zhì)存在差異性。

3 討論與結(jié)論

ACPase是非絕對(duì)專(zhuān)一性的磷酸酯酶，具有多種同工酶，不同的環(huán)境條件會(huì)誘發(fā)出新的同工酶[11]。該試驗(yàn)通過(guò)鹽析、層析過(guò)濾等方法得到相對(duì)純度較高的ACPase，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。

ACPase性質(zhì)的研究對(duì)闡明其在細(xì)胞中的功能十分重要。盡管對(duì)植物組織、水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)的研究已有報(bào)道，但對(duì)白玉菇中ACPase的研究鮮有報(bào)道。木豆中ACPase的最適pH為4.0，刺身中ACPase的最適pH為4.4，仙人掌中ACPase最適pH為4.4，而該試驗(yàn)中白玉菇ACPase最適pH為4.5，與木豆和刺身的最適pH接近[8，12-13]。該研究中測(cè)得白玉菇ACPase的Km值為0.031 mmol/L，草魚(yú)中ACPase的Km值為3.56 mmol/L[14]，刺身ACPase的Km值為0.081 6 mmol/L[8]。該研究得出白玉菇ACPase最適溫度為40 ℃，低于麥胚芽、仙人掌中ACPase的最適溫度[12-13]，在測(cè)定酶的最適溫度中發(fā)現(xiàn)，在溫度上升至50 ℃時(shí)，酶的活性再次升高，推測(cè)白玉菇ACPase可能有熱激活現(xiàn)象，楊立紅等[8，14]對(duì)斑玉蕈、草魚(yú)和刺參的ACPase研究中也發(fā)現(xiàn)了熱激活現(xiàn)象，但熱激活溫度不同，草魚(yú)和斑玉蕈均為60 ℃，刺參為70 ℃。說(shuō)明不同來(lái)源的ACPase酶學(xué)特征存在差異。

該試驗(yàn)體外檢測(cè)了不同重金屬離子對(duì)ACPase活性的影響，發(fā)現(xiàn)重金屬離子Hg2+、Pb2+、Ag+和Cd2+對(duì)ACPase酶活性均有明顯的抑制作用。這與陳素麗等[4，8，10，14]的研究結(jié)果一致。該試驗(yàn)白玉菇粗酶液經(jīng)Sephadex G-200層析柱純化后出現(xiàn)3個(gè)活力峰，楊杰等[15]已報(bào)道ACPase通常存在多種同工酶，因此推斷白玉菇中ACPase可能存在3種同工酶。該試驗(yàn)只對(duì)酶活力高的酶進(jìn)行了研究。該酶以不同的同工酶存在于不同生物中，導(dǎo)致了該酶的酶學(xué)特征存在差異，這也是生物不斷進(jìn)化為適應(yīng)不同物種生長(zhǎng)和代謝所需要的結(jié)果。重金屬離子能使大多數(shù)酶活力受到抑制，推測(cè)可能重金屬離

子與酶的活性部位結(jié)合，使酶的構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而影響酶的活性。因此，在栽培環(huán)境中要嚴(yán)格金屬離子的含量，為高產(chǎn)栽培創(chuàng)建優(yōu)質(zhì)條件。

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