馬貴芳，辛海波，修 莉，孫朝霞，張 華

（1北京市園林綠化科學(xué)研究院，綠化植物育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西晉中 030801；3沈陽市渾南區(qū)城鄉(xiāng)建設(shè)綜合執(zhí)法中心，沈陽 110000）

0 引言

蕎麥(Fagopyrum esculentumMoench.)隸屬蓼科，自花授粉、生育期短、適應(yīng)性廣、種質(zhì)資源豐富，是一種原產(chǎn)于中國且廣泛分布的一年生或多年生雙子葉草本植物，主要種植在亞洲和東歐地區(qū)[1]。蕎麥基因型多樣，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要有甜蕎和苦蕎[2]。蕎麥作為一種藥食同源作物，含有豐富的淀粉、維生素、脂肪及微量元素鉀、鈣、鎂等，同時(shí)含有多種人體必須氨基酸和抗氧化化合物，這些物質(zhì)在疾病預(yù)防或治療中發(fā)揮著重要的作用[3-5]。近年來，蕎麥作為一種生產(chǎn)營養(yǎng)保健品和功能食品的健康作物受到越來越多的關(guān)注，以蕎麥為原料的產(chǎn)品越來越多，如蕎麥殼枕頭、蕎麥茶、蕎麥酒、蕎麥餅等，這使得蕎麥在全球的產(chǎn)量日益增加[6-8]。蕎麥籽粒難脫殼的性狀，極大地限制了蕎麥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。常見的蕎麥脫殼方法有撞擊式脫殼和碾壓脫殼，這些方法在很大程度上使蕎麥的外觀受到嚴(yán)重破壞，且脫殼效率低、產(chǎn)率低，均無法達(dá)到規(guī)?；a(chǎn)[9-10]。此外，蕎麥的脫殼處理方式還有采用水浸泡、蒸制、烘干后再進(jìn)行脫殼處理，這樣的脫殼方式勢必破壞苦蕎麥仁的營養(yǎng)成分，且工序繁雜，出仁（胚）率低，難以得到理想的產(chǎn)品原料[11]。改良蕎麥種子裂殼性狀，提高蕎麥加工效率、減少營養(yǎng)流失，是目前育種的主要目標(biāo)之一。近年來，研究表明蕎麥殼性狀受遺傳和發(fā)育的調(diào)控，蕎麥殼細(xì)胞的排列方式、細(xì)胞壁降解相關(guān)酶的含量、胚乳與殼之間蠟質(zhì)角質(zhì)層的合成及細(xì)胞壁合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控均發(fā)揮著重要作用，這使果殼主要組成物質(zhì)發(fā)生差異代謝，呈現(xiàn)出殼厚度的差異性狀。因此，本研究進(jìn)展從以上幾個方面概述了蕎麥殼性狀相關(guān)基因及代謝物的變化，以期為薄殼蕎麥育種提供全面的理論依據(jù)。

1 蕎麥分類及果殼的成分和細(xì)胞結(jié)構(gòu)

根據(jù)脫殼的難易程度，蕎麥可分為稻谷型和非稻谷型兩種。非稻谷型外殼較厚，且緊緊附著在胚乳上，去除難度大；而稻谷型外殼較薄且松散，不附著在胚乳上，容易去除（如圖1所示）。相比稻谷型蕎麥，非稻谷型蕎麥在卵巢中脈附近的表皮下出現(xiàn)了一層薄薄的細(xì)胞（圖1c），在衰敗花的子房中，細(xì)胞層更厚，且木質(zhì)素含量更高（圖1d,e），這是外殼和胚乳之間存在附著力的原因之一。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞層出現(xiàn)在花芽長軸長度在0.8～1.8 mm時(shí)，這表明此類細(xì)胞的分裂發(fā)生在卵巢發(fā)育早期（圖2）[12-14]。研究者對稻谷型蕎麥與非稻谷型蕎麥的雜交后代分析發(fā)現(xiàn)，稻谷型易脫殼性狀可能是由一個隱性純合基因控制，但該基因尚未被報(bào)道[15]。研究表明果殼成分包含有木質(zhì)素、纖維素、半纖維素和果膠等，其含量決定了果殼的厚度和機(jī)械性能是否良好。如長角果在成熟過程中木質(zhì)素和纖維素的比例對果莢發(fā)育和開裂至關(guān)重要，木質(zhì)素的積累導(dǎo)致內(nèi)壁組織變厚，從而促進(jìn)果莢的開裂[16]。大豆在成熟時(shí)，背部和腹部的豆莢會形成一個脫落層，并且有1,4-β-葡聚糖酶和內(nèi)聚半乳糖醛酸酶積累在在裂解區(qū)，在成熟過程中其含量逐漸增多，這是導(dǎo)致豆莢破裂的原因之一[17-19]。此外，有研究表明脫落現(xiàn)象發(fā)生時(shí)，除了需要酶作用之外，也需要小蛋白(15k～25 kD)和蠟質(zhì)的生物合成和分泌，其在分離細(xì)胞的表面形成了可擴(kuò)展的細(xì)胞外基質(zhì)，有助于果莢開裂及籽粒脫殼[20]。

圖1 非稻谷型(NT)品種(Hokkai T8和Manten-Kirari)和稻谷型(RT)品種(Mekei T28)的卵巢和果實(shí)的組織學(xué)特征

圖2 蕎麥非稻谷(NT)品種和稻谷(RT)品種花芽細(xì)胞長軸長度及子房中脈表皮下周壁細(xì)胞組織學(xué)特征

果殼作為種子的重要組成部分，由子房壁發(fā)育而來，對胚乳和胚起到保護(hù)作用[21]。如表1所示，不同品種殼的成分大致相同[22-23]。其中木質(zhì)素在植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整性方面發(fā)揮重要作用，纖維素在細(xì)胞壁拉伸強(qiáng)度發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[24-26]。木質(zhì)素積累量越多，其細(xì)胞壁越容易開裂，而纖維素含量越多，其細(xì)胞壁的韌性越強(qiáng)，越不容易開裂[27-28]。吳朝昕[29]研究表明蕎麥厚殼和薄殼不同品種間纖維素、半纖維素及木質(zhì)素含量之間存有明顯的差距。SONG等[30]研究發(fā)現(xiàn)在蕎麥種子發(fā)育成熟過程中，木質(zhì)素和纖維素的含量均增加，但難脫殼品種在后期發(fā)育過程中，木質(zhì)素含量下降，纖維素含量增加。SUANUM等[31]在紅豆中也同樣發(fā)現(xiàn)了此規(guī)律。此外，蕎麥殼的厚度及是否易脫殼與其細(xì)胞類型及排列密切相關(guān)。李淑久等[32]發(fā)現(xiàn)苦蕎殼除內(nèi)表皮、外表皮外，在內(nèi)外表皮間有多層厚壁組織細(xì)胞；而甜蕎在內(nèi)外表皮間由3層厚壁組織細(xì)胞組成；野生蕎麥品種在內(nèi)外表皮間由一層厚壁組織細(xì)胞和一層石細(xì)胞構(gòu)成。吳朝昕[29]研究發(fā)現(xiàn)難脫殼苦蕎品種‘晉蕎2號’和易脫殼苦蕎品種‘小米蕎’的果殼均由外表皮、橫向厚壁組織、縱向厚壁組織和內(nèi)表皮四部分組成，其中易脫殼品種果殼厚壁組織較薄，外表皮和橫向厚壁組織的纖維素含量較低，木質(zhì)素含量較高。在蕎麥殼生長發(fā)育形成期，LI等[33]發(fā)現(xiàn)纖維素及半纖維素合成酶基因在難脫殼品種中高表達(dá)，易脫殼品種中低表達(dá)，這也可能是造成果殼薄厚差異的關(guān)鍵因素。

表1 蕎麥殼主要成分

2 酶在種殼開裂過程中的功能

果殼殼裂性狀被認(rèn)為與葉子及果實(shí)脫落具有共同的特征，均發(fā)生在精確的位置，且伴隨著細(xì)胞壁的崩解和細(xì)胞的分離[34]。脫落過程分為4個時(shí)期：脫落區(qū)分化、響應(yīng)脫落信號、脫落激活（該時(shí)期細(xì)胞壁和胞外基質(zhì)發(fā)生變化誘導(dǎo)器官分離）和保護(hù)層形成及脫落后橫向分化（圖3）[35-36]。在此過程中，細(xì)胞壁松弛相關(guān)的、編碼木葡聚糖轉(zhuǎn)糖基酶/水解酶(XTHs)、膨脹素(EXPs)等基因發(fā)生特異表達(dá)，這將有利于細(xì)胞壁降解酶進(jìn)一步發(fā)揮作用[37-38]。細(xì)胞壁主要成分纖維素被纖維素酶(CELs)水解為單糖，果膠被多聚半乳糖醛酸酶(PGs)水解為β-半乳糖醛酸，這使得細(xì)胞內(nèi)聚力喪失，從而產(chǎn)生裂縫[39-40]。研究表明，在果莢開裂時(shí)檢測到與脫落相關(guān)的酶如PGs、CELs活性均有所增加[41-43]，這在大豆及擬南芥中均被證明[17-38]。如圖4所示，在成熟綠色莢果的背側(cè)縫合線處，薄壁細(xì)胞構(gòu)成了大豆莢開裂區(qū)(DZ)，在腹側(cè)縫合線下面由薄壁細(xì)胞組成裂縫區(qū)，且DZ細(xì)胞呈空泡化增加；在成熟黃色莢果，背側(cè)閥瓣邊緣已經(jīng)分開，并且僅通過纖維帽細(xì)胞彼此連接，裂口區(qū)的細(xì)胞全部塌陷，腹側(cè)瓣膜分離，DZ細(xì)胞坍縮，有效地分離了瓣膜邊緣。目前尚未有人測定蕎麥籽粒形成過程中薄殼及厚殼蕎麥品種果膠酶及纖維素酶含量差異。

圖3 脫落區(qū)形成和器官分離的模型圖

圖4 大豆莢成熟期兩個階段背側(cè)和腹側(cè)莢果開口區(qū)橫切面的光學(xué)電子顯微圖

3 蠟質(zhì)角質(zhì)層在種子外殼脫落過程中的功能

在外殼脫落過程中，控制蠟質(zhì)角質(zhì)層類物質(zhì)合成和分泌的基因表達(dá)上調(diào)是普遍特征，這表明果皮表皮上產(chǎn)生的脂質(zhì)與外殼和穎果間的粘連是相關(guān)的[44]。大豆、番茄和擬南芥的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)顯示，在脫落發(fā)生早期，蠟質(zhì)角質(zhì)層合成的相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)早于細(xì)胞壁降解酶編碼基因[45]。近些年來研究發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)角質(zhì)層成分變化比細(xì)胞壁分解酶的改變對器官分離的調(diào)控更加顯著，如番茄蠟質(zhì)缺陷突變體表現(xiàn)出花器官融合，推測這是由于植物表皮細(xì)胞的脂質(zhì)可以提供一層防水的保護(hù)層，防止發(fā)育過程中組織異常粘連，而失去這層保護(hù)層后導(dǎo)致花器官發(fā)生融合[46-48]。研究表明，脂質(zhì)合成后被分泌的部位對于脫殼性狀至關(guān)重要，如調(diào)控大麥脂質(zhì)生物合成代謝的基因?yàn)镹ud基因，屬于乙烯響應(yīng)因子(ERF)家族，該轉(zhuǎn)錄因子蛋白可激活外種皮里特定脂質(zhì)的產(chǎn)生，跨過果皮層分泌到外表皮，不能起到分離果實(shí)和殼的作用，造成外殼和穎果粘連，因此有稃大麥穎果難以脫殼，而裸大麥易脫殼（見圖5）[35,49]。水稻穎果中Os06ERF基因（Nud的同源基因）在花后7天達(dá)到最高水平，早于大麥Nud（花后14天），但其在花后不到21天就停止了表達(dá)[50]。這種表達(dá)的時(shí)間偏差可能導(dǎo)致Os06ERF不能激活脂質(zhì)合成途徑，從而不能控制水稻殼性狀。將大麥Nud基因在自身啟動子驅(qū)動下轉(zhuǎn)化水稻，發(fā)現(xiàn)其仍然提早停止表達(dá)（花后21天），類似水稻內(nèi)源Os06ERF的表達(dá)模式，無法作用于水稻脂質(zhì)合成途徑（圖6）。由此可見，Nud基因在水稻和大麥穎果中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制可能不同，也可能是水稻脫殼性狀主要受細(xì)胞壁代謝等途徑而非脂質(zhì)合成途徑調(diào)控。擬南芥WIN1/SHN1基因（Nud的同源基因）被證明主要在脫落和裂開區(qū)等細(xì)胞分離區(qū)域表達(dá)，對脂質(zhì)生物合成途徑和發(fā)育過程中組織的分離起著重要的作用[51-53]。目前蕎麥籽粒發(fā)育過程中蠟質(zhì)角質(zhì)層的變化尚未被報(bào)道。

圖5 大麥穎果橫切面的光學(xué)電子顯微圖

圖6 穎果橫切面的光學(xué)電子顯微圖

4 轉(zhuǎn)錄因子對殼發(fā)育的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factors，TFs)對基因的調(diào)控作用目前已被廣泛研究[54]。轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控細(xì)胞壁主要成分纖維素和木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)控殼裂性狀。植物細(xì)胞壁主要由初生壁、次生壁和胞間層三部分組成，具有機(jī)械支持、保護(hù)和物質(zhì)輸導(dǎo)的作用，其中次生壁增厚在植物的花藥、果莢開裂中發(fā)揮重要作用，調(diào)控作用的研究多集中在次生壁合成方面[55-56]。擬南芥次生細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及其生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)如圖7所示[57]。

4.1 NAC轉(zhuǎn)錄因子

NAC蛋白是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族，參與調(diào)節(jié)多種生物過程，包括抗逆性、木質(zhì)部的形成[58]。AIDA等[59]首先報(bào)道了并命名了NAC結(jié)構(gòu)域。之后NAC轉(zhuǎn)錄因子被克隆并其抑制頂端分生組織的分化[60]。2005年，MITSUDA等[61]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中的花藥開裂可能是由兩個密切相關(guān)但復(fù)雜冗余的NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的，一個是NST1，它僅在花藥壁中少量表達(dá)，另一個是NST2，它在花藥中表達(dá)強(qiáng)烈但活性有限，這兩個基因的表達(dá)導(dǎo)致擬南芥花藥內(nèi)膜次生壁增厚，從而導(dǎo)致花藥不能開裂缺陷，這顯示NAC轉(zhuǎn)錄因子可能對次生壁增厚具有一定的作用。2007年，MITSUDA等[62]又證明NST1和NST3通過調(diào)節(jié)擬南芥木質(zhì)組織形成來影響其次生壁的形成。ZHONG等[63]同樣證明了NST1、NST2和NST3是調(diào)節(jié)擬南芥花序莖和下胚軸的次生壁形成的關(guān)鍵調(diào)控因子，且三者存在功能冗余作用。蕎麥薄殼殼裂性狀與花藥開裂性狀具有相似性，LI等[33]對厚殼和薄殼品種的蕎麥籽粒發(fā)育4個時(shí)期（開花后5、10、15、20天）的差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn)，NAC轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控蕎麥殼厚的關(guān)鍵基因。WANG等[64]在擬南芥中過表達(dá)FtNAC16，發(fā)現(xiàn)其抑制S型木質(zhì)素合成來降低木質(zhì)素總量，從而負(fù)調(diào)控?cái)M南芥莢果的開裂。

圖7 擬南芥次生細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及其生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

4.2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子

bHLH轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道參與了果實(shí)開裂、心皮和表皮發(fā)育以及脅迫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[65-67]。KIM等[68]研究發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控?cái)M南芥脫落酸介導(dǎo)的反應(yīng)，這進(jìn)一步表明bHLH參與植物果實(shí)開裂的調(diào)控。在花藥發(fā)育過程中，只有小孢子外的胼胝體被降解，小孢子才能被釋放到花藥室中并繼續(xù)發(fā)育成成熟的花粉粒[69]。宋垚等[70]研究表明bHLH可調(diào)控胼胝質(zhì)降解，這對于花藥發(fā)育是至關(guān)重要的。RAJANI等[71]發(fā)現(xiàn)ALC基因編碼與bHLH轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的蛋白質(zhì)，促進(jìn)木質(zhì)化細(xì)胞層之間的不穩(wěn)定非木質(zhì)化細(xì)胞分化，使細(xì)胞分離，果莢開裂。AtbHLH40、AtbHLH73均屬于ALC基因編碼的蛋白，在擬南芥果實(shí)開裂過程中，它能促進(jìn)開裂部位的非木質(zhì)細(xì)胞分化，是果實(shí)開裂的必要調(diào)控因子[72]。SUN等[73]研究發(fā)現(xiàn)FtbHLH70是AtbHLH40的同源基因，其在‘小米蕎’籽粒中表達(dá)量最高且在果實(shí)發(fā)育過程中逐漸增加，這被判斷可能作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控蕎麥脫殼性狀。

4.3 MADS轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[74]。研究表明，MADS轉(zhuǎn)錄因子可參與調(diào)控果實(shí)開裂[75]。在擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，SHP基因（MADS基因家族）的表達(dá)對果實(shí)開裂是至關(guān)重要的。在擬南芥果實(shí)成熟過程中，SHP1和SHP2控制開裂區(qū)細(xì)胞的分化和木質(zhì)化[76]。雙突變體shp1/shp2植株的果實(shí)沒有開裂特征[77]。在此基礎(chǔ)上，LIU等[14]對苦蕎MADS基因家族的SHP基因挖掘中發(fā)現(xiàn)了3個潛在靶基因FtpinG0009028100.01、FtpinG0009028000.01和FtpinG0002495300.01，通過對易脫殼蕎麥和難脫殼蕎麥的比較發(fā)現(xiàn)FtpinG0009028000.01的表達(dá)水平越高，果殼開裂概率越大，反之則相反，在未開裂的果殼中該基因的表達(dá)基本沒有變化，這與擬南芥調(diào)控果實(shí)開裂的SHP基因表達(dá)模式一致，因此，研究者將FtpinG0009028000.01作為研究苦蕎脫殼特性的潛在靶點(diǎn)。

4.4 MYB轉(zhuǎn)錄因子

MYB轉(zhuǎn)錄因子含有高度保守的重復(fù)序列，在植物體內(nèi)發(fā)揮重要作用[78-79]。MYB轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長發(fā)育、反應(yīng)應(yīng)激及物質(zhì)代謝的調(diào)控等過程[80-84]。在植物細(xì)胞壁的生物合成過程中，MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控苯丙素和木質(zhì)素合成途徑中的作用目前已得到了深入的研究，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)一個基于NAC(NAM/ATAF/CUC)-MYB的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制次生壁的生物合成[85]。目前關(guān)于MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究多集中在對花序莖及莖稈次生壁中木質(zhì)素合成的調(diào)控，直接調(diào)控種殼厚度的研究尚少[86]。STEINER等[87]研究發(fā)現(xiàn)在myb26擬南芥突變體中，花藥雖然發(fā)育正常，但在發(fā)育后期花粉成熟，花藥壁收縮導(dǎo)致花粉粒不能釋放，從而導(dǎo)致雄性不育。YANG等[88]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MYB26通過調(diào)控NST1和NST2轉(zhuǎn)錄因子來影響花藥次生壁的木質(zhì)素含量，從而調(diào)控花藥開裂。

5 展望

蕎麥作為中國主要的雜糧作物之一，其籽粒及加工產(chǎn)品具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，但其規(guī)?；a(chǎn)主要受到落粒性、易倒伏、難脫殼以及結(jié)實(shí)率低等性狀的限制。其中，蕎麥脫殼性狀與籽實(shí)生產(chǎn)和加工具有最直接的關(guān)系。目前，有關(guān)蕎麥籽粒脫殼性狀的生理和分子機(jī)制研究較少。本研究進(jìn)展從果殼組成及細(xì)胞排列、酶、蠟質(zhì)角質(zhì)層和轉(zhuǎn)錄因子方面，探討了蕎麥難脫殼這一農(nóng)藝性狀的形成原因。早在1990年YANG等[89]研究發(fā)現(xiàn)蕎麥的薄殼性狀可能是由一對隱形基因所控制，但是由于技術(shù)的限制，沒有克隆到該基因。隨著近年來測序技術(shù)的飛速發(fā)展和基因組學(xué)、代謝組、轉(zhuǎn)錄組等多組學(xué)學(xué)科的深度交叉，研究人員定位和克隆蕎麥脫殼性狀調(diào)控基因的工作量及難度可能會逐步減小。對于蕎麥難脫殼的性狀，在以下幾方面的研究可能會加速蕎麥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展：

（1）在前人的研究中已明確蕎麥的易脫殼性狀與細(xì)胞壁主要成分纖維素和木質(zhì)素的含量及比例相關(guān)，但是具體調(diào)控纖維素及木質(zhì)素生物合成的機(jī)制尚未明確。因此，明確蕎麥籽粒發(fā)育過程中纖維素、木質(zhì)素等的積累規(guī)律及相關(guān)基因的表達(dá)，將為進(jìn)一步揭示蕎麥脫殼的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

（2）果膠酶和纖維素酶作為細(xì)胞壁降解的關(guān)鍵酶，直接影響脫殼的難易，在蕎麥籽粒形成過程中薄殼及厚殼蕎麥品種果膠酶及纖維素酶含量差異有待深入研究。

（3）蠟質(zhì)角質(zhì)層形成部位及其分泌量決定外殼與穎果間是否粘連，是影響籽粒脫殼的關(guān)鍵因素之一。蕎麥籽粒發(fā)育過程中蠟質(zhì)角質(zhì)層變化的研究有待進(jìn)一步深入。

目前，關(guān)于果殼的研究多集中在主要糧食作物上，如豆類、油菜類作物的果莢開裂，且均表現(xiàn)為易脫殼，這些研究表明，莢裂性狀是由多個基因共同調(diào)控的，在分子水平上解析蕎麥殼裂性狀的形成對蕎麥易脫殼性狀的研究及蕎麥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，乃至對植物果實(shí)外殼形成、開裂、脫落等研究十分重要，鑒于目前對這方面的研究基礎(chǔ)較為薄弱，育種家在蕎麥薄殼形成分子機(jī)制的研究中仍然存在著巨大的挑戰(zhàn)。