吳紅根仇 萍彭曉珊彭祖仁李 正李文龍*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥工程學(xué)院，天津300193； 2.省部共建組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193； 3.湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，湖南 懷化418000）

鹽酸青藤堿是從防己科植物青藤Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd.et Wils.或毛青藤Sinomenium acutum（Thn?nb.）Rehd.et Wils.var.cinereumRehd.et Wils.的干燥藤莖中提取制備的一種生物堿單體［1］，是青藤堿的鹽酸鹽形式，具有廣泛的藥理活性，在抗炎、抗免疫、抗腫瘤等方面具有顯著作用［2?4］。在治療過(guò)程中，青藤堿多種制劑聯(lián)用的效果要優(yōu)于單一制劑，由湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司提出的“正清風(fēng)痛寧風(fēng)濕與疼痛‘金三角’ 特色療法”對(duì)風(fēng)濕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等風(fēng)濕病的療效確切，該療法以正清風(fēng)痛寧注射劑電致孔透皮給藥、局部注射，正清風(fēng)痛寧片劑口服聯(lián)合用藥進(jìn)行風(fēng)濕與疼痛的治療，經(jīng)國(guó)內(nèi)多家醫(yī)院使用驗(yàn)證具有良好的治療效果［5］。國(guó)內(nèi)報(bào)道的測(cè)定鹽酸青藤堿制劑的方法多數(shù)為HPLC 法［6?12］，但該方法具有分離時(shí)間長(zhǎng)、流動(dòng)相的消耗大、易造成污染等缺點(diǎn)，且色譜峰不規(guī)則，存在拖尾現(xiàn)象。也有研究人員使用其他方法分析鹽酸青藤堿制劑，包括毛細(xì)管電泳法［13?14］、電化學(xué)法［15］、拉曼和近紅外分析方法［16］，但是這些分析鹽酸青藤堿制劑的方法往往是對(duì)單一劑型進(jìn)行分析，適用范圍有限，尚未見(jiàn)采用毛細(xì)管電泳技術(shù)分析多種鹽酸青藤堿制劑的普適性方法報(bào)道。毛細(xì)管電泳法具有分離效率高、檢測(cè)速度快、樣品量小、操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在中藥分析中有較好的應(yīng)用前景。本研究建立了測(cè)定正清風(fēng)痛寧片、正清風(fēng)痛寧緩釋片、正清風(fēng)痛寧注射液3 種制劑中鹽酸青藤堿含量的普適性毛細(xì)管電泳方法，該方法具有快速高效、綠色環(huán)保的特點(diǎn)，實(shí)用性較好，可用于不同劑型的鹽酸青藤堿制劑的含量測(cè)定。

1 材料

P／ACETMMDQ Plus 毛細(xì)管電泳儀，配備二極管陣列檢測(cè)器，32 Karat software 工作站（美國(guó)Beckman 公司）；未涂層石英毛細(xì)管柱（50.2 cm×50 μm，有效長(zhǎng)度40 cm，美國(guó)Beckman 公司）；針頭式濾膜（0.22 μm，邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司）；AE240 電子天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；SB?5200DTDN 型號(hào)超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；FE 20 PH 計(jì)（瑞士Mettler?Toledo公司）。

鹽酸青藤堿對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司）。樣品由湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，包括正清風(fēng)痛寧片（每片含鹽酸青藤堿20 mg）、正清風(fēng)痛寧緩釋片（每片含鹽酸青藤堿60 mg）和正清風(fēng)痛寧注射液（2 mL ∶50 mg）。硼酸（天津索羅門生物科技有限公司）；Tris（北京索萊寶科技有限公司）；純水（屈臣氏商標(biāo)有限公司）；氫氧化鈉（分析純，凱瑪特天津化工科技有限公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取鹽酸青藤堿對(duì)照品2.50 mg于10 mL 棕色量瓶中，適量純水超聲溶解，冷卻，放至室溫后定容，配制成質(zhì)量濃度為0.25 mg／mL 的對(duì)照品溶液，在4 ℃下貯存?zhèn)溆?，進(jìn)樣前過(guò)0.22 μm 微孔濾膜。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 片劑 取正清風(fēng)痛寧片（批號(hào)1809103）20 片，用小刀除去包衣，研磨成粉末，精密稱取32.94 mg 于25 mL量瓶中，加入適量純水超聲溶解，冷卻，待放至室溫后定容，即得質(zhì)量濃度為1.317 6 mg／mL 的供試品溶液，4 ℃下貯存?zhèn)溆茫M(jìn)樣前過(guò)0.22 μm 微孔濾膜。

2.2.2 緩釋片 取正清風(fēng)痛寧緩釋片（批號(hào)1809101）20片，研磨成粉末，精密稱取32.99 mg 于25 mL 量瓶中，加入適量純水超聲溶解，冷卻，放至室溫后定容，即得質(zhì)量濃度為1.319 6 mg／mL 的供試品溶液，在4 ℃下貯存?zhèn)溆茫M(jìn)樣前過(guò)0.22 μm 微孔濾膜。

2.2.3 注射劑 精密量取正清風(fēng)痛寧注射液（批號(hào)1806401）1 mL（相當(dāng)于鹽酸青藤堿25 mg），置于25 mL量瓶中，加入適量純水稀釋超聲，冷卻，放至室溫后定容，即得質(zhì)量濃度為1 mg／mL 的供試品溶液，在4 ℃下貯存?zhèn)溆茫M(jìn)樣前過(guò)0.22 μm 微孔濾膜。

2.3 電泳條件 采用未涂層石英毛細(xì)管色譜柱（50.2 cm×50 μm，有效長(zhǎng) 度 40 cm）；緩沖液 H3BO3?Tris（0.2 mol／L）；進(jìn)樣方式電動(dòng)進(jìn)樣；電壓10 kV；進(jìn)樣時(shí)間5 s；分離電壓15 kV；在262 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。新的毛細(xì)管柱在首次使用時(shí)需做活化處理，分別用甲醇10 min、純水10 min、1 mol／L NaOH 20 min、純水20 min，運(yùn)行緩沖液沖洗15 min。樣品運(yùn)行前依次用NaOH、水、緩沖液各沖洗5 min，所有溶液進(jìn)毛細(xì)管之前均經(jīng)過(guò)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾。電泳色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 不同樣品毛細(xì)管電泳色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸青藤堿對(duì)照品0.5 mg，按“2.1”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度為0.5 mg／mL 的鹽酸青藤堿對(duì)照品溶液，精密量取適量，置于不同的10 mL棕色量瓶中，加純水稀釋并定容，得到鹽酸青藤堿質(zhì)量濃度分別為15.625、31.25、62.5、125、250、500 mg／mL的溶液，在“2.3”項(xiàng)電泳條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄鹽酸青藤堿的色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝6.50×104X＋541.57（r＝0.998 8），在15.625～500 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一質(zhì)量濃度的鹽酸青藤堿對(duì)照品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果顯示，鹽酸青藤堿峰面積和遷移時(shí)間的RSD 分別為1.82%、0.45%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取片劑粉末，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得鹽酸青藤堿的峰面積和遷移時(shí)間的RSD 分別為1.34%、1.25%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取片劑粉末，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得鹽酸青藤堿峰面積、遷移時(shí)間RSD 分別為1.80%、0.86%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取片劑粉末32.9 mg，平行6 份，分別加入鹽酸青藤堿質(zhì)量相當(dāng)于0.491 mg 的對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鹽酸青藤堿加樣回收率試驗(yàn)（n＝6）

2.4.6 檢測(cè)限 將樣品逐級(jí)稀釋，在“2.3”項(xiàng)條件下計(jì)算峰面積響應(yīng)值與基線噪音的強(qiáng)度，以S／N ＝3 為檢測(cè)限，測(cè)得結(jié)果為0.613 8 μg／mL。

2.5 樣品含量測(cè)定 取鹽酸青藤堿制劑3 種劑型各3 批，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算含量和遷移時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3 種鹽酸青藤堿制劑含量測(cè)定結(jié)果（n＝9）

3 討論與結(jié)論

緩沖液在毛細(xì)管電泳分析中起著決定性作用，本實(shí)驗(yàn)嘗試了磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、硼砂?氫氧化鈉緩沖液、硼酸?氫氧化鈉緩沖液、硼酸?硼砂緩沖液、Tris?鹽酸緩沖液、硼酸?Tris 緩沖液。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)只有硼酸能夠?qū)㈦s質(zhì)峰與樣品峰分開(kāi)，而且Tris 能夠有效的改善拖尾。在選定了緩沖液種類之后，對(duì)緩沖液的pH 進(jìn)行優(yōu)化，分別在pH 6.24、6.43、6.5、6.6、6.83 下進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)只有在pH 6.5 的時(shí)候分離效果最佳，在這個(gè)環(huán)境下雜質(zhì)峰和樣品峰能夠完全基線分離，并且基線噪音干擾最小，且峰形最美觀。電壓的大小影響出峰速度，電壓較大時(shí)出峰速度快，但易造成基線不穩(wěn)，也可能使峰的分離效果不好，電壓較小時(shí)，能實(shí)現(xiàn)峰的分離，但易造成拖尾，本實(shí)驗(yàn)在電壓分別為10、15、20 kV 的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在電壓為15 kV 時(shí)，峰的分離效果最好。

通過(guò)建立毛細(xì)管電泳方法，在4 min 內(nèi)將鹽酸青藤堿制劑中的物質(zhì)完全分離，這種方法與現(xiàn)有的分離鹽酸青藤堿的方法相比，明顯縮短了分析時(shí)間，并且大大減少了有毒試劑的消耗。因此，該方法簡(jiǎn)便環(huán)保，穩(wěn)定可靠，具有一定實(shí)用性，可快速鑒定鹽酸青藤堿，以期為其制劑質(zhì)量的進(jìn)一步研究提供參考。