亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        基于UHPLC?Q?TOF?MS/MS 技術(shù)快速分析杜仲抗補(bǔ)體活性部位的入血成分

        2021-06-15 14:08:16颯賈佳溫泉何明珍閩馮育林楊世林
        中成藥 2021年4期
        關(guān)鍵詞:杜仲正丁醇補(bǔ)體

        郭 颯賈 佳溫 泉何明珍*姚 閩馮育林楊世林

        (1.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌330006; 2.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,江西 南昌330006)

        補(bǔ)體在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用,其激活主要通過經(jīng)典和旁路兩條途徑。補(bǔ)體過度激活會(huì)導(dǎo)致人體正常的組織產(chǎn)生損傷,在許多疾病的發(fā)病過程中扮演著重要角色,如急性肺損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[1]。目前,對(duì)于補(bǔ)體的抑制已成為治療諸多疾病的首要關(guān)注點(diǎn)。據(jù)報(bào)道,中藥材中的諸多成分,如黃酮、多糖、甾體等[2]均具有較好的抗補(bǔ)體活性。

        杜仲Eucommia ulmoidesOliv.,為杜仲科植物,為名貴的中藥材,主要分布于陜西、甘肅、河南、湖北、江西、安徽等省區(qū)[3]?,F(xiàn)代研究表明,杜仲的主要成分包括黃酮、苯丙素、木脂素等,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其具有降血壓、降血糖、保肝、抗炎等活性[4]。同時(shí),現(xiàn)代研究表明,抗炎活性與抗補(bǔ)體活性息息相關(guān)[5],然而杜仲的抗補(bǔ)體活性研究卻鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位進(jìn)行補(bǔ)體抑制活性檢測(cè),結(jié)果顯示乙酸乙酯與正丁醇部位均具有較好的抗補(bǔ)體活性;其次,在前期實(shí)驗(yàn)中課題組對(duì)乙酸乙酯部位和正丁醇部位的成分進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)2 個(gè)部位有相交的部分,只是含量不同,因此,基于UHPLC?Q?TOF?MS/MS 技術(shù),對(duì)相交部分含量較高的正丁醇部位的入血成分進(jìn)行研究,并快速鑒別了體內(nèi)12 種原型入血成分,以期為杜仲的進(jìn)一步利用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料

        SpectraMax i3 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices 公司);Triple TOFTM5600+高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Sciex 公司);Analyst TF 1.6 和peakview 1.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)Sciex公司);LC?30A 超高液相色譜儀(日本島津公司),配置LC?30AD 高壓輸液泵、CBM?20A 系統(tǒng)控制器、SIL?30AC 自動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)Molecular Devices 公司);Sartorious BT25S型分析天平(十萬分之一,德國(guó)賽多利斯公司);N?1001D?OSB2100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(南京泰諾施格科學(xué)儀器有限公司);KQ250DB 型數(shù)控超聲清洗器(鞏義市予華儀器有限公司)。

        京尼平苷(批號(hào)J?028?161216)、京尼平(批號(hào)10080?201409)、異綠原酸C(批號(hào)PRF8060542)對(duì)照品均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。水(廣東屈臣氏食品飲料有限公司);巴比妥緩沖液(pH 7.4,北京雷根生物技術(shù)有限公司);肝素鈉和綿羊血(北京索萊寶科技有限公司);溶血素(上海延慕有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)Fisher 公司);甲酸(色譜純,美國(guó)Sigma 公司);其余試劑為分析純。

        杜仲采自江西吉水縣,經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院高級(jí)工程師姚閩鑒定為杜仲科杜仲屬植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥樹皮。

        2 方法

        2.1 藥材提取 取杜仲藥材500 g,粉碎后用80%乙醇加熱回流提取2 次,每次1 h,分別依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取,減壓回收溶劑后,即得相應(yīng)部位萃取物,減壓干燥,備用。

        2.2 補(bǔ)體經(jīng)典途徑CH50測(cè)定

        2.2.1 供試品溶液制備 稱取杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 個(gè)部位萃取物適量。依次用30 μL DMSO、770 μL BBS 溶液超聲溶解。用BBS 溶液對(duì)倍稀釋成8 個(gè)濃度的供試品溶液(1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256)。

        2.2.2 補(bǔ)體的效價(jià)測(cè)定 參考文獻(xiàn)[6],取一定的豚鼠血清(補(bǔ)體),制備成1 ∶2 的溶液,并對(duì)倍稀釋成1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256 溶液。取1 ∶3 000溶血素100 μL、上述各濃度補(bǔ)體200 μL 和2%SRBC 溶液100 μL,溶于200 μL BBS 溶液中,混勻,置于37 ℃水浴溫育30 min,離心后取上清在405 nm 處測(cè)定吸光度(A)。以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn),選擇達(dá)到相似吸光度的最低補(bǔ)體濃度作為正常溶血所需要的臨界補(bǔ)體濃度。

        2.2.3 藥物經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性測(cè)定 吸取“2.2.2”項(xiàng)下確定的臨界補(bǔ)體濃度與供試品溶液,分別加入100 μL 溶血素和2% SRBC 溶液,于37 ℃水浴反應(yīng)30 min,離心,取上清液,405 nm 處測(cè)定吸光度(A)。

        2.3 液相條件 參考文獻(xiàn)[7],Welch Ultimate XB?C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動(dòng)相0.1% 甲酸(A)?乙腈(B),梯度洗脫(0.01~4 min,5% B;4~10 min,5%~10% B;10~25 min,10%~13% B;25~37 min,13%~27% B;37~45 min,2%~90% B;45~49 min,90%B;49~50 min,90%~5%B;50~56 min,5%B);柱溫40 ℃;體積流量0.3 mL/min;進(jìn)樣量2 μL。

        2.4 質(zhì)譜條件 在負(fù)離子模式下采用電噴霧電離源(ESI);噴霧電壓(ISVF)-4 500 V;霧化器(GS1)和輔助器(GS2)均為50 psi(1 psi=6.895 kPa);質(zhì)量掃描范圍為m/z50~1 250;數(shù)據(jù)采集時(shí)間為56 min;采用母離子觸發(fā)的子離子(TOF?MS?IDA?MS/MS)掃描方式;碰撞能量(CE)-35 eV;碰撞能量疊加(CES)15 eV。

        2.5 生物樣品采集 取SD 大鼠7 只,隨機(jī)分為杜仲給藥組(5 只)和正常組(2 只),杜仲給藥組給藥劑量為12 g/kg,空白組按12 g/kg 劑量給予生理鹽水。分別于給藥后0.5、1、2、4、6 h 對(duì)各組大鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢取血約300 μL,離心,取上清,保存于-40 ℃冰箱中備用。

        2.6 生物樣品處理 取0.5、1、2、4、6 h 待測(cè)血漿各30 μL 混合于4 mL 離心管中,加入50 μL 甲酸,再加入5倍量甲醇沉淀蛋白,渦旋,離心,取上清液,氮?dú)獯蹈桑?0%甲醇100 μL 復(fù)溶,渦旋,離心,取2 μL 上清液進(jìn)行UHPLC?Q?TOF?MS/MS 分析。

        3 結(jié)果

        3.1 經(jīng)典途徑補(bǔ)體效價(jià)測(cè)定 將補(bǔ)體用BBS 溶液對(duì)倍稀釋成8 個(gè)濃度后加到溶血體系中,用于評(píng)價(jià)其效價(jià),見圖1。當(dāng)稀釋度為1 ∶2~1 ∶32 時(shí),溶血率為100%,顯示達(dá)到全溶血狀態(tài);當(dāng)補(bǔ)體稀釋度為1 ∶64 時(shí),全溶血率為(68.49±6.1)%,未引起全溶血,表明個(gè)體之間有一定的差異性。因此,稀釋度為1 ∶32 的豚鼠血清作為經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體實(shí)驗(yàn)中所使用的補(bǔ)體濃度。

        圖1 經(jīng)典途徑不同稀釋度豚鼠血清的效價(jià)(%,,n=3)

        3.2 抗補(bǔ)體活性部位確定 以肝素鈉為陽性對(duì)照藥[CH50為(0.028±0.006)mg/mL],分別對(duì)杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 個(gè)部位萃取物進(jìn)行經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體抑制活性測(cè)試,得到乙酸乙酯和正丁醇部位萃取物經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性CH50值分別為0.072、0.049 mg/mL,石油醚和水部位萃取物無活性。結(jié)果見圖2。

        圖2 杜仲各部位抗補(bǔ)體活性

        3.3 入血成分 采用UHPLC?Q?TOF?MS/MS 技術(shù)對(duì)大鼠血漿進(jìn)行入血成分分析,通過與對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比,綜合對(duì)照品的保留時(shí)間及質(zhì)譜信息,對(duì)本實(shí)驗(yàn)所得圖譜進(jìn)行篩查和鑒定。在大鼠空白血漿中未出現(xiàn)而在大鼠給藥血漿和杜仲正丁醇部位萃取物中相對(duì)應(yīng)位置共同存在的色譜峰,即為杜仲正丁醇部位萃取物原型吸收入血成分,通過此方法共鑒定出12 種原型入血成分。見圖3、表1。

        表1 杜仲正丁醇部位萃取物原型入血成分鑒定

        圖3 各樣品總離子流圖

        3.4 入血成分解析 化合物1 為檸檬酸,一級(jí)質(zhì)譜保留時(shí)間在1.32 min 時(shí),出現(xiàn)m/z為173.008 9 的峰,推測(cè)為[M?H2O]-的峰,以其作為母離子進(jìn)行全掃描,產(chǎn)生2 個(gè)主要的碎片離子,碎片m/z129.019 1 為母離子失去一個(gè)CO2分子的[M?CO2]-峰,碎片m/z111.009 4 為母離子失去一個(gè)H2O 分子和CO2分子的[M?CO2?H2O]-峰,經(jīng)對(duì)照品對(duì)照,鑒定為檸檬酸,其分子式C6H8O7,為有機(jī)酸類。

        化合物2 為4?glucopyranosyloxy?3?benzoic acid,一級(jí)質(zhì)譜保留時(shí)間為3.32,PeakView 中XIC Manager 軟件推測(cè)其分子式C14H18O9,該化合物二級(jí)質(zhì)譜中,產(chǎn)生碎片離子m/z167.034 4、152.010 8、123.044 5、108.021 5 母離子丟失162 Da 后得到167.034 4 碎片離子,可能含有香草醛結(jié)構(gòu)。因此,推測(cè)該化合物為4?glucopyranosyloxy?3?benzoic acid。

        化合物3 為京尼平苷,一級(jí)質(zhì)譜保留時(shí)間在3.69 min時(shí),出現(xiàn)m/z為211.061 2 的峰,推測(cè)為[M?Glu]-的峰,以其作為母離子進(jìn)行全掃描,產(chǎn)生了2 個(gè)主要的碎片離子,分別為碎片m/z193.050 4 為母離子失去一個(gè)水分子[M?H2O]-峰和碎片m/z167.071 5 為母離子失去一個(gè)甲基分子的[M?CO2]-峰,經(jīng)對(duì)照品對(duì)照,鑒定為京尼平苷,分子式C16H22O10,為環(huán)烯醚萜類。

        化合物4 為京尼平,一級(jí)質(zhì)譜保留時(shí)間在15.33 min時(shí),出現(xiàn)m/z為207.066 1 的峰,推測(cè)為[M?H2O]-的峰,以其作為母離子進(jìn)行全掃描,產(chǎn)生2 個(gè)主要的碎片離子,碎片m/z177.054 7 為母離子失去一個(gè)甲氧基分子的[M?CH3O]-峰,經(jīng)對(duì)照品對(duì)照,鑒定為京尼平,分子式C11H14O5,為環(huán)烯醚萜苷類。

        化合物5 為異綠原酸C,一級(jí)質(zhì)譜保留時(shí)間在33.14 min時(shí),出現(xiàn)m/z為353.088 0 的峰,推測(cè)為 [M?Glu]-的峰,以其作為母離子進(jìn)行全掃描,產(chǎn)生了1 個(gè)主要的碎片離子,即為碎片m/z353.088 0 為母離子失去一個(gè)葡萄糖分子的[M?Glu]-峰,經(jīng)對(duì)照品對(duì)照,鑒定為異綠原酸C,分子式C25H24O12,為苯丙素類。

        4 討論

        杜仲是我國(guó)傳承千年的名貴藥材,其用途廣泛,被稱為“植物黃金”[8]。本實(shí)驗(yàn)通過抗補(bǔ)體經(jīng)典途徑研究了杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 個(gè)部位萃取物的抗補(bǔ)體活性,結(jié)果表明,杜仲石油醚和水部位萃取物無明顯抗補(bǔ)體活性,而正丁醇部位萃取物的抗補(bǔ)體活性最好,為杜仲的最佳抗補(bǔ)體活性部位。

        UHPLC?Q?TOF?MS/MS 具有分 析快速、分辨率 高、靈敏度好、重復(fù)性好等特點(diǎn),是天然產(chǎn)物鑒定復(fù)雜成分的有力手段[9?10]。本實(shí)驗(yàn)采用此分析技術(shù)對(duì)杜仲入血成分進(jìn)行研究,共鑒定出12 種原型入血成分。根據(jù)入血成分可能是中藥的有效活性成分[11]這一觀點(diǎn),結(jié)合參考文獻(xiàn)[12?13] 分析推測(cè)其可能為潛在的抗補(bǔ)體活性成分。

        本實(shí)驗(yàn)從抗補(bǔ)體活性與入血成分兩方面對(duì)杜仲進(jìn)行研究,以期有助于拓寬對(duì)杜仲藥用功效的認(rèn)知,同時(shí)也為進(jìn)一步討論杜仲的藥效活性提供參考。

        猜你喜歡
        杜仲正丁醇補(bǔ)體
        “補(bǔ)體法”在立體幾何解題中的妙用
        正丁醇和松節(jié)油混合物對(duì)組織脫水不良的補(bǔ)救應(yīng)用
        補(bǔ)體因子H與心血管疾病的研究進(jìn)展
        抗dsDNA抗體、補(bǔ)體C3及其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)于診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎損傷的臨床意義
        大風(fēng)子正丁醇部位化學(xué)成分的研究
        中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:48
        HPLC法同時(shí)測(cè)定杜仲-當(dāng)歸藥對(duì)中5種成分
        中成藥(2018年8期)2018-08-29 01:28:14
        三葉青藤正丁醇部位化學(xué)成分的研究
        中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:08
        中華抱莖蓼正丁醇部位化學(xué)成分的研究
        中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:25
        流感患兒血清免疫球蛋白及補(bǔ)體的檢測(cè)意義
        略陽杜仲
        аⅴ天堂国产最新版在线中文| 人人鲁人人莫人人爱精品| 国产女人高潮叫床视频 | 一个人的视频免费播放在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫免| 鲁丝片一区二区三区免费| 亚洲 欧美 国产 日韩 精品| 国产精品天干天干在线观蜜臀| 中文字幕一区二区综合| 国产精品特级毛片一区二区三区| 99久久综合狠狠综合久久| 粉嫩国产白浆在线播放| 久久热免费最新精品视频网站| av永久天堂一区二区三区| 亚洲人成网站77777在线观看 | 国成成人av一区二区三区| 亚洲国产精品久久久久久无码| 少女高清影视在线观看动漫| 岛国精品一区二区三区| 国产视频在线观看一区二区三区| 99无码精品二区在线视频| 日日碰狠狠躁久久躁96avv| japanese色国产在线看视频| 国产精品一区二区熟女不卡| 日韩aⅴ人妻无码一区二区| 91精品一区国产高清在线gif| 黄色网页在线观看一区二区三区| 日韩三级一区二区不卡| 无码人妻av一二区二区三区 | 天天看片视频免费观看| 伊在人亚洲香蕉精品区麻豆| 色和尚色视频在线看网站| 成人综合网站| 国产精品亚洲А∨天堂免下载 | 开心久久综合婷婷九月| 欧美成人免费全部| 精品少妇人妻成人一区二区| 亚洲中文字幕一区二区在线| 美丽人妻在夫前被黑人| 日本一本久道| 亚洲二区精品婷婷久久精品|