亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        基于UHPLC?Q?TOF?MS/MS 技術快速分析杜仲抗補體活性部位的入血成分

        2021-06-15 14:08:16颯賈佳溫泉何明珍閩馮育林楊世林
        中成藥 2021年4期
        關鍵詞:杜仲正丁醇補體

        郭 颯賈 佳溫 泉何明珍*姚 閩馮育林楊世林

        (1.江西中醫(yī)藥大學,江西 南昌330006; 2.江西省藥品檢驗檢測研究院,江西 南昌330006)

        補體在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用,其激活主要通過經(jīng)典和旁路兩條途徑。補體過度激活會導致人體正常的組織產(chǎn)生損傷,在許多疾病的發(fā)病過程中扮演著重要角色,如急性肺損傷、類風濕性關節(jié)炎等[1]。目前,對于補體的抑制已成為治療諸多疾病的首要關注點。據(jù)報道,中藥材中的諸多成分,如黃酮、多糖、甾體等[2]均具有較好的抗補體活性。

        杜仲Eucommia ulmoidesOliv.,為杜仲科植物,為名貴的中藥材,主要分布于陜西、甘肅、河南、湖北、江西、安徽等省區(qū)[3]?,F(xiàn)代研究表明,杜仲的主要成分包括黃酮、苯丙素、木脂素等,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其具有降血壓、降血糖、保肝、抗炎等活性[4]。同時,現(xiàn)代研究表明,抗炎活性與抗補體活性息息相關[5],然而杜仲的抗補體活性研究卻鮮見報道。本實驗首先對杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位進行補體抑制活性檢測,結果顯示乙酸乙酯與正丁醇部位均具有較好的抗補體活性;其次,在前期實驗中課題組對乙酸乙酯部位和正丁醇部位的成分進行了研究,發(fā)現(xiàn)2 個部位有相交的部分,只是含量不同,因此,基于UHPLC?Q?TOF?MS/MS 技術,對相交部分含量較高的正丁醇部位的入血成分進行研究,并快速鑒別了體內(nèi)12 種原型入血成分,以期為杜仲的進一步利用開發(fā)奠定基礎。

        1 材料

        SpectraMax i3 多功能酶標儀(美國Molecular Devices 公司);Triple TOFTM5600+高分辨質(zhì)譜儀(美國Sciex 公司);Analyst TF 1.6 和peakview 1.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Sciex公司);LC?30A 超高液相色譜儀(日本島津公司),配置LC?30AD 高壓輸液泵、CBM?20A 系統(tǒng)控制器、SIL?30AC 自動進樣器(美國Molecular Devices 公司);Sartorious BT25S型分析天平(十萬分之一,德國賽多利斯公司);N?1001D?OSB2100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(南京泰諾施格科學儀器有限公司);KQ250DB 型數(shù)控超聲清洗器(鞏義市予華儀器有限公司)。

        京尼平苷(批號J?028?161216)、京尼平(批號10080?201409)、異綠原酸C(批號PRF8060542)對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司。水(廣東屈臣氏食品飲料有限公司);巴比妥緩沖液(pH 7.4,北京雷根生物技術有限公司);肝素鈉和綿羊血(北京索萊寶科技有限公司);溶血素(上海延慕有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,美國Fisher 公司);甲酸(色譜純,美國Sigma 公司);其余試劑為分析純。

        杜仲采自江西吉水縣,經(jīng)江西省藥品檢驗檢測研究院高級工程師姚閩鑒定為杜仲科杜仲屬植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥樹皮。

        2 方法

        2.1 藥材提取 取杜仲藥材500 g,粉碎后用80%乙醇加熱回流提取2 次,每次1 h,分別依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取,減壓回收溶劑后,即得相應部位萃取物,減壓干燥,備用。

        2.2 補體經(jīng)典途徑CH50測定

        2.2.1 供試品溶液制備 稱取杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 個部位萃取物適量。依次用30 μL DMSO、770 μL BBS 溶液超聲溶解。用BBS 溶液對倍稀釋成8 個濃度的供試品溶液(1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256)。

        2.2.2 補體的效價測定 參考文獻[6],取一定的豚鼠血清(補體),制備成1 ∶2 的溶液,并對倍稀釋成1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256 溶液。取1 ∶3 000溶血素100 μL、上述各濃度補體200 μL 和2%SRBC 溶液100 μL,溶于200 μL BBS 溶液中,混勻,置于37 ℃水浴溫育30 min,離心后取上清在405 nm 處測定吸光度(A)。以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標準,選擇達到相似吸光度的最低補體濃度作為正常溶血所需要的臨界補體濃度。

        2.2.3 藥物經(jīng)典途徑抗補體活性測定 吸取“2.2.2”項下確定的臨界補體濃度與供試品溶液,分別加入100 μL 溶血素和2% SRBC 溶液,于37 ℃水浴反應30 min,離心,取上清液,405 nm 處測定吸光度(A)。

        2.3 液相條件 參考文獻[7],Welch Ultimate XB?C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動相0.1% 甲酸(A)?乙腈(B),梯度洗脫(0.01~4 min,5% B;4~10 min,5%~10% B;10~25 min,10%~13% B;25~37 min,13%~27% B;37~45 min,2%~90% B;45~49 min,90%B;49~50 min,90%~5%B;50~56 min,5%B);柱溫40 ℃;體積流量0.3 mL/min;進樣量2 μL。

        2.4 質(zhì)譜條件 在負離子模式下采用電噴霧電離源(ESI);噴霧電壓(ISVF)-4 500 V;霧化器(GS1)和輔助器(GS2)均為50 psi(1 psi=6.895 kPa);質(zhì)量掃描范圍為m/z50~1 250;數(shù)據(jù)采集時間為56 min;采用母離子觸發(fā)的子離子(TOF?MS?IDA?MS/MS)掃描方式;碰撞能量(CE)-35 eV;碰撞能量疊加(CES)15 eV。

        2.5 生物樣品采集 取SD 大鼠7 只,隨機分為杜仲給藥組(5 只)和正常組(2 只),杜仲給藥組給藥劑量為12 g/kg,空白組按12 g/kg 劑量給予生理鹽水。分別于給藥后0.5、1、2、4、6 h 對各組大鼠進行眼眶靜脈叢取血約300 μL,離心,取上清,保存于-40 ℃冰箱中備用。

        2.6 生物樣品處理 取0.5、1、2、4、6 h 待測血漿各30 μL 混合于4 mL 離心管中,加入50 μL 甲酸,再加入5倍量甲醇沉淀蛋白,渦旋,離心,取上清液,氮氣吹干,50%甲醇100 μL 復溶,渦旋,離心,取2 μL 上清液進行UHPLC?Q?TOF?MS/MS 分析。

        3 結果

        3.1 經(jīng)典途徑補體效價測定 將補體用BBS 溶液對倍稀釋成8 個濃度后加到溶血體系中,用于評價其效價,見圖1。當稀釋度為1 ∶2~1 ∶32 時,溶血率為100%,顯示達到全溶血狀態(tài);當補體稀釋度為1 ∶64 時,全溶血率為(68.49±6.1)%,未引起全溶血,表明個體之間有一定的差異性。因此,稀釋度為1 ∶32 的豚鼠血清作為經(jīng)典途徑抗補體實驗中所使用的補體濃度。

        圖1 經(jīng)典途徑不同稀釋度豚鼠血清的效價(%,,n=3)

        3.2 抗補體活性部位確定 以肝素鈉為陽性對照藥[CH50為(0.028±0.006)mg/mL],分別對杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 個部位萃取物進行經(jīng)典途徑抗補體抑制活性測試,得到乙酸乙酯和正丁醇部位萃取物經(jīng)典途徑抗補體活性CH50值分別為0.072、0.049 mg/mL,石油醚和水部位萃取物無活性。結果見圖2。

        圖2 杜仲各部位抗補體活性

        3.3 入血成分 采用UHPLC?Q?TOF?MS/MS 技術對大鼠血漿進行入血成分分析,通過與對照品進行對比,綜合對照品的保留時間及質(zhì)譜信息,對本實驗所得圖譜進行篩查和鑒定。在大鼠空白血漿中未出現(xiàn)而在大鼠給藥血漿和杜仲正丁醇部位萃取物中相對應位置共同存在的色譜峰,即為杜仲正丁醇部位萃取物原型吸收入血成分,通過此方法共鑒定出12 種原型入血成分。見圖3、表1。

        表1 杜仲正丁醇部位萃取物原型入血成分鑒定

        圖3 各樣品總離子流圖

        3.4 入血成分解析 化合物1 為檸檬酸,一級質(zhì)譜保留時間在1.32 min 時,出現(xiàn)m/z為173.008 9 的峰,推測為[M?H2O]-的峰,以其作為母離子進行全掃描,產(chǎn)生2 個主要的碎片離子,碎片m/z129.019 1 為母離子失去一個CO2分子的[M?CO2]-峰,碎片m/z111.009 4 為母離子失去一個H2O 分子和CO2分子的[M?CO2?H2O]-峰,經(jīng)對照品對照,鑒定為檸檬酸,其分子式C6H8O7,為有機酸類。

        化合物2 為4?glucopyranosyloxy?3?benzoic acid,一級質(zhì)譜保留時間為3.32,PeakView 中XIC Manager 軟件推測其分子式C14H18O9,該化合物二級質(zhì)譜中,產(chǎn)生碎片離子m/z167.034 4、152.010 8、123.044 5、108.021 5 母離子丟失162 Da 后得到167.034 4 碎片離子,可能含有香草醛結構。因此,推測該化合物為4?glucopyranosyloxy?3?benzoic acid。

        化合物3 為京尼平苷,一級質(zhì)譜保留時間在3.69 min時,出現(xiàn)m/z為211.061 2 的峰,推測為[M?Glu]-的峰,以其作為母離子進行全掃描,產(chǎn)生了2 個主要的碎片離子,分別為碎片m/z193.050 4 為母離子失去一個水分子[M?H2O]-峰和碎片m/z167.071 5 為母離子失去一個甲基分子的[M?CO2]-峰,經(jīng)對照品對照,鑒定為京尼平苷,分子式C16H22O10,為環(huán)烯醚萜類。

        化合物4 為京尼平,一級質(zhì)譜保留時間在15.33 min時,出現(xiàn)m/z為207.066 1 的峰,推測為[M?H2O]-的峰,以其作為母離子進行全掃描,產(chǎn)生2 個主要的碎片離子,碎片m/z177.054 7 為母離子失去一個甲氧基分子的[M?CH3O]-峰,經(jīng)對照品對照,鑒定為京尼平,分子式C11H14O5,為環(huán)烯醚萜苷類。

        化合物5 為異綠原酸C,一級質(zhì)譜保留時間在33.14 min時,出現(xiàn)m/z為353.088 0 的峰,推測為 [M?Glu]-的峰,以其作為母離子進行全掃描,產(chǎn)生了1 個主要的碎片離子,即為碎片m/z353.088 0 為母離子失去一個葡萄糖分子的[M?Glu]-峰,經(jīng)對照品對照,鑒定為異綠原酸C,分子式C25H24O12,為苯丙素類。

        4 討論

        杜仲是我國傳承千年的名貴藥材,其用途廣泛,被稱為“植物黃金”[8]。本實驗通過抗補體經(jīng)典途徑研究了杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 個部位萃取物的抗補體活性,結果表明,杜仲石油醚和水部位萃取物無明顯抗補體活性,而正丁醇部位萃取物的抗補體活性最好,為杜仲的最佳抗補體活性部位。

        UHPLC?Q?TOF?MS/MS 具有分 析快速、分辨率 高、靈敏度好、重復性好等特點,是天然產(chǎn)物鑒定復雜成分的有力手段[9?10]。本實驗采用此分析技術對杜仲入血成分進行研究,共鑒定出12 種原型入血成分。根據(jù)入血成分可能是中藥的有效活性成分[11]這一觀點,結合參考文獻[12?13] 分析推測其可能為潛在的抗補體活性成分。

        本實驗從抗補體活性與入血成分兩方面對杜仲進行研究,以期有助于拓寬對杜仲藥用功效的認知,同時也為進一步討論杜仲的藥效活性提供參考。

        猜你喜歡
        杜仲正丁醇補體
        “補體法”在立體幾何解題中的妙用
        正丁醇和松節(jié)油混合物對組織脫水不良的補救應用
        補體因子H與心血管疾病的研究進展
        抗dsDNA抗體、補體C3及其他實驗室指標對于診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎損傷的臨床意義
        大風子正丁醇部位化學成分的研究
        中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:48
        HPLC法同時測定杜仲-當歸藥對中5種成分
        中成藥(2018年8期)2018-08-29 01:28:14
        三葉青藤正丁醇部位化學成分的研究
        中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:08
        中華抱莖蓼正丁醇部位化學成分的研究
        中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:25
        流感患兒血清免疫球蛋白及補體的檢測意義
        略陽杜仲
        陜西畫報(2016年1期)2016-12-01 05:35:28
        亚洲熟妇夜夜一区二区三区| 久久精品成人无码观看不卡| 国产95在线 | 欧美| 加勒比黑人在线| 一区二区三区精品亚洲视频| 一个色综合中文字幕人妻激情视频 | 男女裸交无遮挡啪啪激情试看| 人妻丰满熟妇av无码区hd| 亚洲av第一区综合激情久久久 | 日本大片在线看黄a∨免费| 国产精品中文第一字幕| 日韩国产自拍视频在线观看| 亚洲av无码成h在线观看| 久久综合九色综合网站| 日本特黄a级高清免费大片| 成人黄色片久久久大全| 少妇夜夜春夜夜爽试看视频| 国产人妻久久精品二区三区| 精品91精品91精品国产片| 亚洲国产一区一区毛片a| 2019最新中文字幕在线观看| 久久99精品国产99久久| 少妇高潮无码自拍| 亚洲av高清天堂网站在线观看| 伊人久久大香线蕉综合影院首页| 一国产区在线观看| 91麻豆精品激情在线观最新| 欧美午夜理伦三级在线观看| 人妻忍着娇喘被中进中出视频| 成人无码无遮挡很H在线播放| 国产av天堂一区二区二区| 国内最真实的xxxx人伦| 东北无码熟妇人妻AV在线| 日韩精品视频免费福利在线观看| 男女18视频免费网站| 99精品国产一区二区三区a片| 日本手机在线| 午夜蜜桃视频在线观看| 国产婷婷色一区二区三区在线| 国产第一草草影院| 在线观看女同一区二区|