李禎鑫黃 真程汝濱鐘曉明

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053）

松茸主要分布在吉林、云南、四川、西藏等地［1?2］，含有多糖、多酚、麥角甾醇、揮發(fā)性有機(jī)化合物等大量活性成分［3?4］，近年來由于其所含多糖具有較高的藥用價(jià)值而受到廣泛關(guān)注［5］。研究表明，來自松茸子實(shí)體的水溶性松茸多糖是該藥材主要有效物質(zhì)之一，具有良好的藥理活性，如抗腫瘤［6?7］、免疫調(diào)節(jié)［8］、抗氧化［9］，并可通過抑制人體內(nèi)黑色素瘤細(xì)胞生成黑色素來起到美白肌膚的效果［10］，在化妝品領(lǐng)域有著的廣闊的開發(fā)前景。

目前，松茸尚未被《中國藥典》 收錄，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的缺乏制約了該藥材及其相關(guān)制劑的開發(fā)利用。因此，本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［11?13］ 報(bào)道的方法，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化松茸水提物提取工藝，并通過柱前衍生化HPLC 法分析其單糖組成，以期為該藥材后續(xù)開發(fā)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（配置Waters 1525 二元泵、Waters 2489 紫外檢測器、Waters 2707 自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower 2 工作站，美國Waters 公司）；DZF 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；AL104 電子天平［梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］；KQ?300DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE?52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；UV?1800 紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 試劑與藥物 松茸于2018 年采自云南香格里拉，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室陳孔榮副教授鑒定為口蘑科口蘑屬真菌松茸Tricholoma matsutake。葡萄糖（批號(hào)S10S9I69833）、甘露糖（批號(hào)A16O6L4546）、半乳糖（批號(hào)Z22J9H64187）、木糖（批號(hào)B02M6W1）、巖藻糖（批號(hào)M23F8K29918）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司；1?苯基?3?甲基?5?吡唑啉酮（批號(hào)K1820098）購于阿拉丁試劑（上海）有限公司；磷酸二氫鉀（批號(hào)20181207）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取葡萄糖對照品5.74 mg，置于25 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2.5 mL，置于5 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（終質(zhì)量濃度為114.8 μg／mL）。

2.1.2 供試品溶液制備 稱取藥材粉末（過50 目篩）0.5 g，置于50 mL 圓底燒瓶中，室溫下4 000 r／min 離心10 min，取上清液，置于100 mL 量瓶中，加水定容，即得。2.1.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液0.15、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65 mL，置于10 mL 試管中，加水至1 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL 濃硫酸，搖勻，沸水浴20 min，冷卻至室溫，在490 nm 波長下檢測吸光度。以多糖提取率為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.009 5X－0.001 1（r＝0.999 5），在17.22～74.62 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 正交試驗(yàn) 在前期單因素試驗(yàn)及方法學(xué)考察基礎(chǔ)上，選擇提取溫度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）作為影響因素，多糖提取率作為評價(jià)指標(biāo)（Y），L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，因素水平見表1。精密稱定藥材粉末3 份，每份0.5 g，置于圓底燒瓶中進(jìn)行回流提取，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

由此可知，各因素影響程度依次為D＞A＞B＞C，除提取次數(shù)（P＜0.05）外各因素均無明顯影響。最終確定，最優(yōu)工藝為藥材加入50 倍量水，在90 ℃下回流提取2 h，重復(fù)3 次。

2.1.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱定3 份藥材粉末，每份2.0 g，按優(yōu)化工藝進(jìn)行提取，測得提取率分別為17.53%、17.48%、17.32%，平均17.44%，RSD 為0.63%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

2.2 單糖組成分析

2.2.1 色譜條件 Waters Xbridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相25 mmol／L 磷酸鹽緩沖液（A）?乙腈（B），梯度洗脫（1～10 min，18% B；10～12 min，18%～20% B；12～60 min，20% B）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長250 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖10.19、25.14、11.82、3.22、2.70 mg，置于1 mL 量瓶中，加水定容，分別精密吸取500、350、350、150、300 μL，置于2 mL 容量瓶中，加水定容，即得。

2.2.3 粗多糖制備 精密稱取藥材提取物5.00 g，熱水溶解，加4 倍量無水乙醇沉淀，4 ℃下靜置過夜，4 000 r／min離心10 min，棄去上清液，沉淀干燥，即得，性狀為棕褐色固體粉末，質(zhì)量為0.894 6 g。

2.2.4 供試品溶液制備 精密稱取粗多糖10.0 mg，置于5 mL量瓶中，加水定容，精密吸取1.0 mL 至5 mL 試管中，加入4 mol／L 三氟乙酸1.0 mL，橡膠塞密封，110 ℃下加熱4 h，冷卻至室溫，置于真空干燥箱中干燥，1.0 mL 甲醇吹洗試管，干燥，重復(fù)3 次，200 μL 蒸餾水復(fù)溶，即得。

2.2.5 PMP 衍生化 取水解后的供試品溶液200 μL，加入0.5 mol／L PMP 甲醇溶 液、0.3 mol／L NaOH 溶液各200 μL，充分溶解后移至2 mL 離心管中，70 ℃水浴加熱100 min，冷卻至室溫，加入0.3 mol／L HCl，充分混勻，加入1.0 mL 三氯甲烷充分振蕩，取上清液，重復(fù)3 次，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.6 方法學(xué)考察

2.2.6.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液700、550、400、250、100 μL，置 于1 mL 量瓶中，加水定 容，按“2.2.5”項(xiàng)下方法衍生化，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以各單糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表4，可知均在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表4 各單糖線性關(guān)系

2.2.6.2 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下方法衍生化，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖峰面積RSD 分別為1.26%、0.76%、0.97%、1.04%、0.65%，表明儀器精密度良好。

2.2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取粗多糖，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下方法衍生化，于0、2、4、8、16 h 在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖峰面積RSD分別為1.13%、2.41%、1.21%、1.48%、1.31%，表明溶液在16 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取粗多糖6 份，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下方法衍生化，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖峰面積RSD 分別為2.48%、2.13%、2.31%、1.73%、2.11%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各單糖含量已知的粗多糖6 份，精密加入等同于樣品量的對照品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下方法衍生化，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖平均加樣回收率分別為100.37%、95.21%、101.89%、103.78%、97.71%，RSD 分別為1.38%、2.14%、1.95%、1.72%、2.72%。

2.2.7 分析結(jié)果 精密稱取粗多糖3 份，每份10.0 mg，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下方法衍生化處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖組成，摩爾比為1 ∶3.39 ∶1.19 ∶0.24 ∶0.40，其中葡萄糖、半乳糖、甘露糖質(zhì)量占比較高，分別為55.12%、19.41%、16.28%。HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 各單糖HPLC 色譜圖

3 討論

3.1 提取工藝選擇 陳煉紅［14］等采用響應(yīng)面法優(yōu)化松茸多糖復(fù)合酶法提取工藝，但其最終提取率僅為6.95%，而工藝條件要求高，成本昂貴，工業(yè)化生產(chǎn)限制較多。本實(shí)驗(yàn)采用熱回流法優(yōu)化提取工藝，條件溫和，操作簡單，松茸水提物中多糖提取率可達(dá)17.44%，適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

3.2 色譜條件選擇 在水相中加入適量緩沖鹽時(shí)，能改善單糖衍生物的HPLC 色譜圖峰型，故本實(shí)驗(yàn)考察了乙酸銨、磷酸鹽緩沖系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸銨緩沖系統(tǒng)雖然在pH為5.5 左右時(shí)可使峰型對稱，拖尾程度降低，但存在緩沖鹽用量大、水相易霉變、出峰時(shí)間不穩(wěn)定等諸多問題，故選用磷酸鹽緩沖系統(tǒng)，此時(shí)拖尾因子小，出峰穩(wěn)定，分離度好，適用于XBridge C18柱對單糖衍生物的分析。

3.3 單糖組成分析 劉剛［15］等初步確定，松茸多糖由葡萄糖、木糖和半乳糖組成；高瑞希［16］等發(fā)現(xiàn)，松茸多糖含有木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸。本實(shí)驗(yàn)采用PMP 柱前衍生化HPLC 法分析松茸多糖的單糖組成，發(fā)現(xiàn)其中同時(shí)存在甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖，并首次建立同時(shí)對上述5 種單糖進(jìn)行定量測定的方法，可用于松茸及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對松茸水提物提取工藝及單糖組成進(jìn)行了系統(tǒng)研究，先采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，再通過PMP 柱前衍生化HPLC 法分析單糖組成，發(fā)現(xiàn)有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖5 種，摩爾比為1 ∶3.39 ∶1.19 ∶0.24∶0.40。而且，該方法準(zhǔn)確度和精密度良好，靈敏度高，操作簡便，可用于松茸多糖組成分析，也可為其他藥材的相關(guān)研究提供參考依據(jù)。