王秀敏葉金翠江蕾蕾張夢婕李晶晶石森林*

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州310000； 2.杭州醫(yī)學院，浙江 杭州310000）

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.、三角葉黃連Coptis dletoideaC.Y.Cheng et Hsiao 或云連Coptis teetaWall 的干燥根莖，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功能［1］。其有效成分為黃連總生物堿，主要代表為小檗堿、巴馬丁、黃連堿、藥根堿、表小檗堿等［2?3］。現(xiàn)代醫(yī)學證明，黃連總生物堿具有改善糖代謝、調(diào)節(jié)血脂、降低血壓、抑菌抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種藥理作用［4?9］。

要獲得理想的成方制劑，原料藥質(zhì)量至關(guān)重要，原料藥的質(zhì)量又在很大程度上取決于其干燥工藝。干燥方法不同不僅會影響其有效成分的含量，還會造成其物理性質(zhì)和粉體學性質(zhì)的改變，從而影響后續(xù)的制劑研究。本實驗以黃連總生物堿原料藥為研究對象，以其物理性質(zhì)、粉體學性能以及吸濕潮解性作為評價指標，通過采用真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥這3 種方法，通過物理指紋圖譜對其可壓性進行表征、分析、驗證，預測原料藥粉末和固體制劑用輔料之間的壓縮兼容性，以期篩選一種適合黃連總生物堿制劑的干燥方法，也為中藥提取物干燥工藝的選擇及中藥制劑的開發(fā)提供一定的科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 BT?1000 型粉體綜合特性測試儀（丹東市百特儀器有限公司）；B?290 噴霧干燥儀（瑞士Buchi 公司）；DZF6050 型真空干燥箱（上海頓克儀器科技有限公司）；JA2003N 電子天平（上海精密儀器有限公司）；XS105 分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；Avanti J?26XP 高效離心機［貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司］；BT?2001 激光粒度分布儀（丹東市百特儀器有限公司）；SU?8010 場發(fā)射掃描電鏡（日本Hitach 公司）；Agi?lent1200 series 高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 試劑與藥物 黃連（浙江中醫(yī)藥大學飲片廠，產(chǎn)地四川，批號20171201），經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學資源鑒定教研室教師鑒定為正品。黃連總生物堿（實驗室自制，批號分別為20180503、20180507、20180514、20180615 ）；鹽酸小檗堿（純 度98.38%，批號MUST?17110105）、鹽酸藥根堿（純度94.00%，批號MUST?17110702）、鹽酸巴馬?。兌?9.01%，批號MUST?17022604）、鹽酸黃連堿（純度99.99%，批號MUST?17061705）對照品，均購于成都曼思特生物科技有限公司；鹽酸表小檗堿對照品（純度98.0%，上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號18011831）。甲醇、乙腈為色譜純（美國Tedia 公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 5 種生物堿含量測定

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取對照品鹽酸小檗堿1.54 mg、鹽酸巴馬汀0.87 mg、鹽酸黃連堿1.03 mg、鹽酸表小檗堿0.73 mg、鹽酸藥根堿0.62 mg，甲醇溶解并定容至25 mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 黃連總生物堿原料藥粉碎，過100 目篩，精密稱定約2 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 色譜條件 Dikma C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈?0.05 mol／L 磷酸二氫鉀，磷酸調(diào)節(jié)pH 至4.0；體積流量1.0 mL／min；檢測波長345 nm；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

2.1.4 系統(tǒng)適應性試驗 吸取適量對照品、供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣分析。在該條件下，各成分均能達到基線分離，符合檢測要求，見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.1.3”項色譜條件下進樣。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結(jié)果見表1，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.6 精密度試驗 取“2.1.1”項下對照品溶液適量，在“2.1.3”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，測得小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿峰面積RSD 分別為0.70%、0.73%、0.65%、0.67%、0.59%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液適量，室溫分別放置0、2、4、6、8、12、24 h，在“2.1.3”項色譜條件下測定，測得小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿峰面積RSD 分別為0.42%、0.93%、0.31%、0.30%、0.21%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復性試驗 稱取6 份黃連總生物堿（批號20180913），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣，測得小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿的含量RSD 分別為 0.68%、1.05%、1.90%、0.93%、1.67%，表明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 稱取各成分含量已知的黃連總生物堿粉末9 份，每份約1.8 mg，精密稱定，加入不同體積對照品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

2.2 干燥方法選擇

2.2.1 原料藥制備 根據(jù)實驗室前期確定的方法，采用微波輔助乙醇回流提取黃連總生物堿，并參考文獻［9］ 進行樹脂前處理，將處理好的D101 樹脂濕法1 ∶9 裝柱，1.2 倍柱體積，0.25 g 生藥／mL黃連提取液以2 BV／h 上樣，2 BV 純水以2 BV／h除雜，2 BV 60% 乙醇以2 BV／h 洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60 ℃濃縮至黏稠狀，將其置于蒸發(fā)皿中，進行干燥，即得。

2.2.2 干燥 按“2.2.1”項下方法制備黃連總生物堿洗脫液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，60 ℃濃縮至黏稠狀，將其置于蒸發(fā)皿中，分別于60 ℃真空干燥24 h、－50 ℃冷凍干燥24 h、以入口溫度180 ℃噴霧干燥，一式3 份［10］。

2.2.3 含量測定 精密稱取不同干燥方式獲得的黃連總生物堿約2 mg，甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，濾膜過濾，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見表3，表明不同干燥方式所得黃連總生物堿中5 種成分含量差異不明顯。

表3 干燥方法對生物堿含量的影響（%，， n＝3）Tab.3 Effect of drying method on alkaloid content（%，， n＝3）

表3 干燥方法對生物堿含量的影響（%，， n＝3）Tab.3 Effect of drying method on alkaloid content（%，， n＝3）

2.2.4 外觀形態(tài) 通過掃描電子顯微鏡觀察比較3 種干燥方法所得黃連總生物堿的外觀和表面形態(tài)，結(jié)果見圖2。由此可知，噴霧干燥、真空干燥、冷凍干燥所得粉體大小差異較大，真空干燥與冷凍干燥所得粉體差異不明顯，噴霧干燥所得粉粒較圓整，大小較均一。

圖2 黃連總生物堿掃描電鏡圖（100 μm）Fig.2 Scanning electron micrograph images of alka?loids from C.chinensis（100 μm）

2.2.5 粒徑考察 取不同干燥方法所得黃連總生物堿（原料藥）約1 g，過100 目篩，將其置于激光粒度分布儀（干法）中測量粒徑，結(jié)果見表4。

表4 不同干燥方法所得黃連總生物堿粉末粒徑Tab.4 Particle sizes of total alkaloids powder from C.chinensis obtained by different drying methods

2.2.6 粉體學特征考察

2.2.6.1 休止角（α）取適量黃連總生物堿粉末，將其從一定高度的漏斗中自然下落，求所形成的圓錐和水平板間的角度θ。粉末在圓盤上形成堆集體半徑為r，高度為h，則tanθ＝h／r，重復測定3次，取平均值，結(jié)果見表5。

2.2.6.2 崩潰角（θf）、差角（θd）測定休止角后，提起振子至卡銷處，使其自由落下，當振子落到底部時振動，使平臺上堆積的圓錐體樣品表面塌陷下落，重復操作3 次，用量角器量3 個不同位置上的角度，求其平均值即為崩潰角θf，結(jié)果見表5（差角θd是休止角和崩潰角之差，即θd＝θr－θf）。

表5 干燥方法對黃連總生物堿的粉體學影響（%，，n＝3）Tab.5 Effects of drying method on total alkaloids powder from C.chinensis（%，， n＝3）

表5 干燥方法對黃連總生物堿的粉體學影響（%，，n＝3）Tab.5 Effects of drying method on total alkaloids powder from C.chinensis（%，， n＝3）

2.2.6.3 卡氏指數(shù) 取精密稱定的100 mL 量筒，將待測物均勻由漏斗流入其中，精確稱定質(zhì)量，計算松裝密度（ρb）；采用輕敲法使量筒中的物質(zhì)處于最緊實狀態(tài)，記錄體積，計算振實密度（ρt），重復測定3 次，結(jié)果見表6?？ㄊ现笖?shù)（Cp）計算公式為Cp＝（1－ρb／ρt）×100%，豪斯納比率（HR）計算公式為HR＝ρt／ρb，顆粒間空隙率（ε）計算公式為ε＝ ［（ρt－ρb）／（ρt×ρb）］ ×100%。

表6 干燥方法對黃連總生物堿卡氏指數(shù)的影響（，n＝3）Tab.6 Effect of drying method on the cardinal index of total alkaloids powder from C.chinensis（， n＝3）

表6 干燥方法對黃連總生物堿卡氏指數(shù)的影響（，n＝3）Tab.6 Effect of drying method on the cardinal index of total alkaloids powder from C.chinensis（， n＝3）

2.2.6.4 川北方程 參考文獻［11］，取黃連總生物堿原料藥適量，將其灌入量筒中，敲擊量筒，每50 次記錄體積，直到體積沒有明顯改變，重復測定3 次，根據(jù)公式（n／c）＝（1／ab）＋（n／a），以n／c對n作圖，根據(jù)直線斜率求得a和b，結(jié)果見表7。

表7 干燥方法對黃連總生物堿川北方程的影響Tab.7 Effect of drying method on the North Sichuan equation of total alkaloids from C.chinensis

流動性與密度及表面形態(tài)相關(guān)，密度越大，表面越光滑接近于球形，休止角越小，流動性越好。卡氏指數(shù)大則可壓性好，反之則流動性好，在15%～20%為佳。川北方程中，常量a 表示敲擊次數(shù)為無窮大時相對體積減少分數(shù)，a 越小，流動性越好；b 表示通過敲擊獲得的表觀填充速率，b 越大，填充性能越好。

不同干燥方法所得黃連總生物堿原料藥的休止角均小于40 °，真空干燥＜噴霧干燥＜冷凍干燥；差角，真空干燥＞冷凍干燥＞噴霧干燥；卡式指數(shù)均＜30%，噴霧干燥＜真空干燥＜冷凍干燥；川北方程a 值，真空干燥＜冷凍干燥＜噴霧干燥。3 種不同干燥方法所得的黃連總生物堿原料藥可壓性能差異較小，流動性方面以真空干燥較好，更適合壓片。

2.2.7 吸濕潮解性研究

2.2.7.1 含水量（MC）取黃連總生物堿約0.5 g，于水分測定儀中進行測定，記錄失重率，即為含水量，結(jié)果見表8。

表8 黃連總生物堿水分測定結(jié)果（%，）Tab.8 Moisture determination results of total alkaloids from C.chinensis（%，）

表8 黃連總生物堿水分測定結(jié)果（%，）Tab.8 Moisture determination results of total alkaloids from C.chinensis（%，）

2.2.7.2 吸濕特性參數(shù)（H）參考文獻［12］，取干燥具塞玻璃稱量瓶，置藥物穩(wěn)定性試驗箱（25 ℃，相對濕度75%）中至恒定質(zhì)量，精密稱定質(zhì)量（m1）。取干燥至恒定質(zhì)量的粉末適量，平鋪于上述稱量瓶中，厚度約為1 mm，精密稱定質(zhì)量（m2）。將稱量瓶口敞開，并與瓶蓋同置于上述恒溫條件下，分別于各個時間點精密稱定質(zhì)量（mt），吸濕達到平衡的質(zhì)量記為m平衡，計算吸濕增重和吸濕性H，并繪制吸濕曲線，吸濕增重＝［（mt－m2）／（m2－m1）］ ×100%、H＝ ［（m平衡－m2）／（m2－m1）］ ×100%。結(jié)果見圖3、表9。

圖3 黃連總生物堿的吸濕增重曲線Fig.3 Hygroscopic weight gain curves for total alkaloids from C.chinensis

表9 黃連總生物堿吸濕方程Tab.9 Hygroscopic equations of total alkaloids from C.chinensis

對各樣品的吸濕時間曲線數(shù)據(jù)二項式回歸處理，得到方程y＝at2＋bt＋c，求導r＝dw／dt＝2at＋b。由公式可知吸濕速度也是不斷變化的，再對上述吸濕速度方程求一階導，得到加速度方程r′＝dr／dt＝2a。當t＝0 時，吸濕的初始速度為r0＝b；當達到吸濕平衡時，吸濕速度為0，則達到吸濕平衡的時間t′＝－b／2。

2.2.7.3 相對臨界濕度 分別精密稱取真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥所得原料藥各約0.5 g，進行脫濕平衡，精密稱定質(zhì)量后置于盛有氯化鎂、碳酸鉀、溴化鈉、碘化鉀、氯化鈉、溴化鉀、氯化鉀和硝酸鉀8 種過飽和鹽溶液的干燥器中，于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃保存5 d，定時稱量，計算吸濕率，見圖4。以平衡吸濕率為縱坐標，相對濕度為橫坐標作圖，分別對曲線兩端作切線，切線交點所對應的橫坐標即為黃連總生物堿的臨界相對濕度。

圖4 黃連總生物堿的吸濕平衡曲線（25 ℃）Fig.4 Hygroscopic equilibrium curves for alkaloids from C.chinensis（25 ℃）

由此可知，3 種干燥方法所得黃連總生物堿原料藥含水量差異不明顯，真空干燥＞噴霧干燥＞冷凍干燥；在吸濕過程中所得粉體的吸濕速率，真空干燥＜噴霧干燥＜冷凍干燥；臨界相對濕度，噴霧干燥（77%）＜冷凍干燥（78%）＜真空干燥（80%）。綜上所述，真空干燥所得黃連總生物堿原料藥的吸濕速率相對較低，臨界相對濕度相對較大，吸濕性能較弱，更適合制劑。

2.2.8 物理指紋圖譜及可壓性

2.2.8.1 粉體物理質(zhì)量指標的標準化轉(zhuǎn)換 根據(jù)粉末的物理特性，將其粉體學性質(zhì)歸納為堆積性、流動性、穩(wěn)定性和可壓性4 個方面，作為黃連總生物堿原料藥物理指紋譜的一級指標。將8 個物理指標參數(shù)構(gòu)成物理指紋譜的二級指標，其中ρb和ρt表征堆積性，α 和HR表征流動性，MC和H表征標穩(wěn)定性，ε和Cp表征可壓性。參考相關(guān)文獻和標準［13?15］，將黃連總生物堿原料藥的8 個物理指標轉(zhuǎn)化至0～10 之間，見表10～11。

表10 粉體物理性質(zhì)數(shù)值范圍及轉(zhuǎn)換方式Tab.10 Numerical ranges of powder physical properties and conversion methods

表11 黃連總生物堿相關(guān)物理參數(shù)與轉(zhuǎn)化值（n＝3）Tab.11 Related physical parameters and conversion values of alkaloids from C.chinensis（n＝3）

2.2.8.2 粉體學性質(zhì)分析及物理指紋譜評價 通過雷達圖可以定量直觀展示黃連總生物堿原料藥物理指紋圖譜，見圖5。3 種干燥方法所得粉體的堆積性、流動性、穩(wěn)定性和可壓性指標平均值分別為2.75、3.05、6.24、4.72（真空干燥），1.45、2.99、6.67、7.04（冷凍干燥），1.40、2.89、6.46、6.52（噴霧干燥），即3 種干燥方法堆積性能和流動性能均欠佳（指標平均值＜5），穩(wěn)定性和可壓性均較好（指標平均值＞5），壓片前需加入適宜的輔料。3 種干燥方法所得粉體的雷達圖在直觀上難以判斷，而通過計算物理指紋譜的相似度，可以從整體上比較不同干燥方法所得原料藥的相似度［16］。結(jié)果表明，不同干燥方法下原料藥粉體學性質(zhì)存在差異，噴霧干燥與冷凍干燥的相似度為88.2%，與真空干燥的相似度為36.6%，而冷凍干燥與噴霧干燥的相似度為30.3%。

圖5 不同干燥方法黃連總生物堿原料藥物理指紋圖譜Fig.5 Physical fingerprints of alkaloids from C.chinensis by different drying methods

2.2.8.3 可壓性分析 基于不同干燥方法所得黃連總生物堿原料藥物理指紋譜8 個二級物理指標的半徑值（半徑為10），求算出參數(shù)指數(shù)（index of parameter，IP ）、參數(shù)輪 廓指數(shù)（index of parametric profile，IPP）、良好可壓指數(shù)（index of good compression，IGC）等指標，以評價粉末是否適合直接壓片，并推測其片劑成型性。具體公式為IP＝P≥5／PA，其中P≥5 為二級物理性質(zhì)指標參數(shù)≥5 的數(shù)量，PA為全部物理屬性的數(shù)量；IGC＝IPP×k，IPP為粉體所有物理指標參數(shù)的平均值，k為可靠性因子（多邊形面積／圓面積）。

本研究構(gòu)建的物理指紋圖譜共采用8 個物理指標值，k為0.900。不同干燥方法所得黃連總生物堿原料藥可壓性存在差異，真空干燥，IP＝0.125、IPP＝4.19、IGC＝3.77；冷凍干燥，IP＝0.375、IPP＝4.53、IGC＝4.08；噴霧干燥，IP＝0.375、IPP＝4.32、IGC＝3.89，3 種干燥方法的IP均＜0.5，IPP和IGC均＜5，表明流動性和可壓性不理想，需加相應輔料進行進一步改善。

2.2.8.4 可行性驗證 本實驗采用了粉末直接壓片來直觀反映中藥提取物的壓縮成型性［17］。分別取3 種干燥方法所得提取物，于單沖壓片機在相同壓力下壓成平面片劑，采用硬度測定儀測定放置一段時間后片劑的硬度，并計算片劑抗張強度σ（2fc／πhd），其 中fc為硬度（N），d為片徑（mm），h為片厚（mm），σT為抗張強度（MPa），結(jié)果見表12，可知以真空干燥所得的原料藥可壓性最合適。

表12 黃連總生物堿抗張強度（， n＝3）Tab.12 Tensile strengths of alkaloids from C.chinensis（， n＝3）

表12 黃連總生物堿抗張強度（， n＝3）Tab.12 Tensile strengths of alkaloids from C.chinensis（， n＝3）

3 討論

中藥原料藥的干燥過程中存在一系列復雜的化學變化，其中涉及到藥物各成分間的相互作用及物料穩(wěn)定性的改變等，不僅會影響原料藥的粉體學、吸濕潮解性等一系列的物理特性，也會影響其化學性質(zhì)的變化，進而影響后續(xù)的制劑工序，最終影響臨床療效。

人用藥品注冊技術(shù)國際協(xié)調(diào)會（ICH）在2009年出臺的文件中提出了“質(zhì)量源于設(shè)計（quality by design，QbD）”的概念，強調(diào)對產(chǎn)品和工藝的理解，以及制劑原料物理屬性、工藝、成品質(zhì)量之間的關(guān)系。張毅等［18］根據(jù)粉末關(guān)鍵質(zhì)量屬性，提出建立提取物粉末物理指紋圖譜，用以評價提取物原料的質(zhì)量一致性，并幫助理解其物理質(zhì)量屬性對制劑成型性的影響，有助于QbD 在制劑研發(fā)和生產(chǎn)中的應用。

本實驗以黃連總生物堿原料藥為研究對象，對不同干燥方法所得原料藥進行評價，并采用物理指紋圖譜對其可壓性進行分析驗證，以期為中藥提取物干燥方法的選擇提供一定的參考。本實驗考察了3 種干燥方法，冷凍干燥所得粉末較疏松、易粘連且不利于大批量制備；噴霧干燥所得粉末粒徑較小且均一，但比表面積大，使其易吸濕，且流動性相對欠缺，不利于后續(xù)制劑的成型工藝；真空干燥所得粉末易粉碎、成本低、制備簡易且流動性、成型性、吸濕性均相對較好，更適合后續(xù)的制劑研究。