龐荔丹魏嬌嬌苗 壯王安君吳家勁薛明真朱立俏

（山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南250355）

萊菔子為十字花科植物蘿卜Raphanus sativusL.的干燥成熟種子。具有消食除脹、降氣化痰之功效，常用于治療飲食停滯、脘腹脹滿、大便秘結、痰壅喘咳等癥［1］。傳統(tǒng)中藥炮制理論認為萊菔子炮制具有“生熟異治，生升熟降”的藥性變化特點，生品主升，長于涌入風痰，炒品主降，長于消食除脹、降氣化痰［2］。目前臨床均以炒萊菔子入藥?，F(xiàn)代研究表明，萊菔子可用于治療高血壓［3］、癌 癥［4］、消化不 良［5］、降血脂［6］、降 血糖［7］等疾病，主要含有硫苷類［8?9］、芥子酸及其寡糖酯［10?11］、芥子堿硫氰酸鹽［12］等成分，其中硫苷類成分為其炮制前后的特征性成分，蘿卜苷（glu?coraphenin，GRE）是其含量最高的硫苷類成分［13］，通過前期研究發(fā)現(xiàn)還含有另一硫苷類成分，暫定名為RS01。而炮制前后芥子堿硫氰酸鹽（si?napine thiocyanate，ST）的含量 未發(fā)生 明顯變化［14］。目前萊菔子均以ST 為指標成分進行提取、炮制及質量控制研究，指標成分缺乏專屬性。另外萊菔子炮制工藝參數(shù)多適用于小量鍋炒的規(guī)模［15］，與炒藥機工業(yè)化炒制的參數(shù)偏差較大。基于此，本實驗以優(yōu)化萊菔子炒藥機炒制工藝為目標，采用Box?Behnken 響應面法，以GRE、RS01 和ST 多指標量化萊菔子的最佳炒制工藝，以期為規(guī)范萊菔子的炮制工藝和工業(yè)化大生產(chǎn)提供科學依據(jù)，保證臨床用藥的安全性和有效性。

1 材料

Agilent1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；MK?30 型炒藥機（江陰市祝塘明科機械廠）；EX225ZH／AD 型電子分析天平（十萬分之一，常州奧豪斯儀器有限公司）；KQ5200 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MP160 多道生理記錄儀（美國Biopac 公司）；HW200s 恒溫平滑肌實驗系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；FLBP?200型萬能高速粉碎機（上海菲力博食品機械有限公司）；GFL?230 電熱鼓風干燥箱（天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司）。蘿卜苷對照品（純度≥98%，美國Cayman 公司，批號0453522?24）；芥子堿硫氰酸鹽對照品（純度≥98%，成都德思特生物技術有限公司，批號DST160910?021）。乙腈、甲醇（色譜純，美國TEDIA 公司）；水為娃哈哈飲用純凈水；其余試劑為分析純。

生萊菔子飲片（生產(chǎn)批號181101），購于山東百味堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學藥學院張芳副教授鑒定為十字花科植物蘿卜RaphanussativusL.的干燥成熟種子。

雄性健康SD 大鼠，體質量（200～220）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，合格證號SCXK（魯）20140007。

2 方法與結果

2.1 蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽、RS01 含量測定

2.1.1 色譜條件 Inertsil ODS?3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，5%～10% A；15～17 min，10%～12.5% A；17～27 min，12.5%～14% A；27～55 min，14%～25% A；55～57 min，25%～70% A；57～70 min，70%～100% A；70～80 min，100% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長225、326 nm；進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒定質量的蘿卜苷對照品12.70 mg、芥子堿硫氰酸鹽對照品10.75 mg，分別置于25 mL 量瓶中，用純凈水將蘿卜苷溶解后定容至刻度，制成0.508 mg／mL對照品溶液，備用；用50% 甲醇將芥子堿硫氰酸鹽溶解后定容至刻度，制成0.43 mg／mL 對照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液制備 取炒萊菔子適量，粉碎，過40 目篩，精密稱取粉末約2 g，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水25 mL 浸泡30 min后，再精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲30 min，靜置，冷卻至室溫，補足減失質量，濾過，取續(xù)濾液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下蘿卜苷對照品溶液1、2、5、10、20、50、80 μL，芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液1、2、5、8、10、15 μL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣10 μL。以峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）進行回歸，得蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽回歸方程分別為Y＝679.1X＋36.36（r＝0.999 8）、Y＝2 826X＋38.83（r＝0.999 8），分別在0.508～40.64、0.43～6.45 μg 范圍內線性關系良好。

2.1.5 系統(tǒng)適應性和專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣。結果，蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽的保留時間分別為5.331、26.027 min，RS01 保留時間為49.093 min，分離度良好。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.6 精密度試驗 取“2.1.2”項下對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣6 次，測得蘿卜苷峰面積RSD 為0.63%，芥子堿硫氰酸鹽峰面積RSD 為0.84%，RS01 峰面積RSD 為0.74%，表明儀器精密度較好。

2.1.7 重復性試驗 取同一炮制條件下的炒萊菔子粉末，按“2.1.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下分別進樣10 μL，測得蘿卜苷峰面積RSD 為1.53%，芥子堿硫氰酸鹽峰面積RSD 為1.84%，RS01 峰面積RSD為1.69%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣，測得蘿卜苷峰面積RSD 為0.89%，芥子堿硫氰酸鹽峰面積RSD 為1.29%，RS01 峰面積RSD 為1.56%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密量取“2.1.3”項下供試品溶液6 份，精密加入蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下各進樣10 μL測定，測得蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽平均加樣回收率分別為98.92%、99.44%，RSD 分別為0.92%、2.35%。

2.1.10 RS01 含量變化表示 RS01 在炮制條件改變后，根據(jù)HPLC 數(shù)據(jù)分析可知其含量會發(fā)生明顯的變化，是具有顯著性的評價指標，但由于缺乏對照品，無法采用標準曲線法進行含量測定。因此，本實驗以RS01 峰面積與所對應飲片質量的比值表示其相對含量。

2.1.11 綜合得分評價指標 參考文獻［16］，以蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽和RS01 為指標成分，采用Box?Behnken 響應面法進行多指標綜合評價，綜合得分（Z）＝蘿卜苷得分×40%＋芥子堿硫氰酸鹽得分×40%＋RS01 得分×20%、指標成分得分（S）＝該指標成分含量／該指標成分所在組中含量的最高值。本實驗單因素考察和響應面分析均以綜合評分為主，各指標得分為輔進行分析。

2.2 單因素試驗

2.2.1 炒制溫度 將炒藥機轉速設置為30 r／min，預熱30 min，取生萊菔子飲片約100 g，置于炒藥機中，分別于180、200、220、240、260 ℃炒制3 min，取出放涼，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項條件下進樣，按“2.1.11”項下方法進行指標得分和綜合得分的計算。結果見表1。

表1 不同炒制溫度下指標成分的指標得分和綜合評分（n＝3）Tab.1 Index scores and comprehensive scores of index components at different processing temperatures（n＝3）

由表1 可知，3 種指標成分均在炮制溫度200 ℃時出現(xiàn)最高值，但芥子堿硫氰酸鹽含量在各溫度下差別不大，同時以綜合評分也在200 ℃時得分最高。因此，選取180、200、220 ℃3 個水平進行響應面優(yōu)化。

2.2.2 炒制時間 將炒藥機轉速設置為30 r／min，預熱30 min，稱取生萊菔子飲片100 g，置于炒藥機中，于200 ℃下分別炒制1、3、5、7 min，取出放涼，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，進行HPLC 含量測定和指標得分、綜合得分的計算。結果見表2。

表2 不同炒制時間下指標成分的指標得分和綜合評分Tab.2 Index scores and comprehensive scores of index components under different processing time

由表2 可知，蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽硫氰酸鹽含量均在炒制時間為3 min 時出現(xiàn)最高值，RS01含量在1 min 時出現(xiàn)了最高值，但3 min 時與最高值十分接近。根據(jù)指標得分為輔，綜合得分為主的分析，選取2、3、4 min 3 個水平進行響應面優(yōu)化。

2.2.3 炒藥機轉速 將炒藥機溫度設置為200 ℃，預熱30 min，稱取生萊菔子飲片100 g，置于炒藥機中，分別于轉速20、30、40 r／min 下炒制3 min，取出放冷，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，進行HPLC 測定和得分計算。結果見表3。

表3 炒藥機不同轉速下指標成分的指標得分和綜合評分Tab.3 Index scores and comprehensive scores of index components at different processing speed

由表3 可知，蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽含量均在30 r／min 出現(xiàn)最高值，RS01 含量在20 r／min 出現(xiàn)最高值，綜合評分以炒制30 r／min 得分最高。因此，選取20、30、40 r／min 3 個水平進行響應面優(yōu)化。

2.3 響應面優(yōu)化實驗

2.3.1 響應面法實驗設計及結果 在單因素試驗的基礎上，以炒制溫度（A）、炒制時間（B）和炒藥機轉速（C）作為考察因素，蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽、RS01 的指標得分（S）和綜合得分（Z）作為響應值，設計3 因素3 水平方案，采用Box?Behnken 中心組合設計原理，經(jīng)Design?Expert V8.0.6 軟件處理，得到3 因素3 水平共17 組試驗，結果見表4。

表4 萊菔子炒制工藝的響應面優(yōu)化結果Tab.4 Results of response surface optimization for stir?frying process of R.sativus

2.3.2 方差分析 應用Design?Expert.V8.0.6 軟件進行分析，得到多元二次回歸模擬方程為Z＝－7.805 18＋0.071 495A＋0.980 42B－0.028 88C－3.310 53×10－3AB＋1.571 15×10－4AC＋3.278 48×10－3BC－1.521 31×10－4A2－0.058 818B2－2.393 56×10－4C2，方差分析見表5。方程決定系數(shù)R2＝0.960 0，校正決定系數(shù)＝0.908 6，表明該模型的擬合程度較好；F＝18.67，P＝0.000 4 ＜0.01，表明回歸方程具有統(tǒng)計學差異；變異系數(shù)（CV%）為3.82%，方程的離散程度較小，且F失擬＝2.04，P＝0.250 5＞0.05，表明方程的失擬程度不具有統(tǒng)計學差異，可用于優(yōu)選萊菔子炒制工藝。另外，一次項A、B、C、二次項A2、B2和兩兩交互項AB對于回歸模型具有顯著性影響，而3 個單因素指標對于響應面回歸模型的影響程度依次為A＞B＞C。

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

2.3.3 響應面3D 圖分析 按“2.3.2”項下得到的回歸方程，利用Design?Expert.V8.0.6 軟件進行萊菔子炒制條件的優(yōu)選，響應面分析見圖2。根據(jù)所得的3D 圖，可通過觀察響應曲面的傾斜度來確定2 個指標對于響應值Z的影響程度，傾斜度越大，則影響程度越高，同時3D 圖的顏色變化和等高線形狀也可作為判斷曲面傾斜度大小的指標，顏色越深則提取出的含量越多，坡度越大，對響應值的影響越顯著，等高線最小橢圓的中心點即為響應值最高點，橢圓形則表示兩因素交互作用明顯，而圓形則反之。因此，可以得出A與B、C的相互作用明顯，A對于Z的影響程度最大的結論。

圖2 炒制溫度、炒制時間和炒藥機轉速間的交互作用Fig.2 Interactions among stir?frying temperature，stir?frying time and rotation speed of herbal medicine roaster

以綜合評分作為響應值并結合單因素考察方法，優(yōu)選出的萊菔子炒制條件為炒制溫度217.09 ℃，炒制時 間 3.05 min，炒制轉 速29.73 r／min?？紤]到實際應用中的可行性，最終確定為炒制溫度220 ℃，炒制時間3 min，炒制轉速30 r／min。

2.3.4 驗證試驗 取1 kg 生萊菔子飲片，共10份，按照響應面法優(yōu)選出的炮制工藝，在200 ℃、2 min、40 r／min，200 ℃、3 min、30 r／min，220 ℃、3 min、30 r／min，220 ℃、3 min、20 r／min，240 ℃、3 min、30 r／min 5 種炮制條件下制備炒萊菔子飲片，每個條件平行制備2 份，結果見表6。由此可知，響應面優(yōu)選的最佳炮制工藝的平均綜合得分為0.990 75，與回歸方程的擬合值1.038 342 761 接近，相對誤差均小于5%，2 組平行樣品的RSD＜3%，表明精密度較好；與相近幾組炮制工藝的數(shù)據(jù)相比，響應面優(yōu)化出的炮制工藝3 個指標的得分和綜合得分均最好，表明響應面模型和回歸方程具有良好的預測性，所優(yōu)選出的萊菔子炮制工藝可行性高，對相關后續(xù)研究具有指導意義。

表6 驗證試驗結果Tab.6 Results of verification tests

2.4 炒萊菔子水提液對大鼠離體十二指腸運動的影響

2.4.1 炒萊菔子水提液制備 取萊菔子飲片適量，置于炒藥機中，設置炒制溫度220 ℃，炒藥機轉速30 r／min，炒制時間3 min，粉碎，加10 倍量水提取2 次，每次0.5 h，濾過，合并提取液，濃縮至質量濃度為1 g／mL，備用。

2.4.2 Kreb’s 營養(yǎng)液制備 稱取NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、MgSO40.15 g、NaH2PO40.21 g、NaHCO31.37 g、CaCl211.1 g、葡萄糖1.8 g，加蒸餾水至1 L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.4.3 大鼠離體十二指腸腸管制備 大鼠禁食不禁水24 h，脫頸椎處死后剖開腹部，剪取近幽門端十二指腸腸管10 cm，置于預冷的Kreb’s 液中，小心分離腸外周結締組織，用預冷的Kreb’s 液沖洗腸內容物，剪成3 cm 長的腸段備用。將腸段置于盛有20 mL Kreb’s 液的恒溫37 ℃浴槽中，持續(xù)通入5% CO2和95% O2混合氣體（1～2 個氣泡／s），每隔15 min 換1 次Kreb’s 液，前負荷1 g，平衡1 h，待腸管收縮穩(wěn)定后進行實驗［18］。分別緩慢向盛有Kreb’s 液的恒溫37 ℃浴槽中加入不同劑量的炒萊菔子水提液，記錄給藥前后的十二指腸腸段收縮的振幅和張力，37 ℃Kreb’s 液沖洗腸段3 次，待大鼠腸段恢復正常收縮頻率后，滴加下一個劑量的炒萊菔子水提液，重復上述步驟。

2.4.4 不同劑量炒萊菔子水提液對大鼠離體十二指腸運動的影響

精密吸取“2.4.1”項下炒萊菔子水提液600 μL，緩慢加入腸管已平衡好的37 ℃恒溫浴槽中，記錄加藥前后腸管變化，按“2.4.3”項下方法依次加入800、1 000、1 200 μL 水提液，觀察離體十二指腸腸管收縮振幅和張力變化。

采用SPSS 17.0 軟件對不同萊菔子樣品給藥前后數(shù)據(jù)結果進行單因素方差分析，Graphpad Prism 8.0.1 軟件將數(shù)據(jù)處理成柱狀圖的形式，結果見圖3。

圖3 炒萊菔子水提液對大鼠離體十二指腸張力和振幅的影響Fig.3 Effect of aqueous extract of stir?fried R.sativus on the tension and amplitude of rats ’isolated duodenum

由此可知，炒萊菔子水提取液在質量濃度為0.03～0.06 mg／mL 時可增大腸收縮的振幅（P＜0.05，P＜0.01），在質量濃度為0.04～0.06 mg／mL時可使腸運動振幅增大（P＜0.05，P＜0.01），表明炒萊菔子水提液具有促進離體十二指腸運動的作用。

3 討論

中藥炮制直接影響臨床療效，明代《本草蒙筌》 中講到“凡藥制造，貴在適中，不及則功效難求，太過則氣味反失［17］”。由單因素考察結果表明，炒制溫度對萊菔子中蘿卜苷和RS01 含量影響較大，生萊菔子中蘿卜苷會發(fā)生酶解反應［13］，萊菔子炒制太過檢測不到蘿卜苷［18］，但炒制溫度對RS01 的報道尚未發(fā)現(xiàn)。由此可見蘿卜苷和RS01 含量的高低是反映炒萊菔子質量的重要專屬性指標。因此采用專屬性的多指標評價方法優(yōu)化萊菔子的炒制工藝，可更全面專屬的反映萊菔子炒制程度對其質量的影響，確定萊菔子炒制中的“火候”要求。

傳統(tǒng)炮制理論認為萊菔子炒制具有“生熟異治、生升熟降”的藥性變化特點，萊菔子炒制性轉沉降，具有消食除脹、降氣化痰之功效，在臨床中作為常用消食藥。但其消食除脹的物質基礎和藥理作用機制并不明確，因此基于上述實驗推測蘿卜苷和RS01 可能為萊菔子炒制“生熟異治”的物質基礎。炒制得當?shù)某慈R菔子可具有促進大鼠離體十二指腸運動。

根據(jù)各指標響應值的回歸模型進行分析，蘿卜苷＝－13.131 33＋0.109 51A＋2.101 44B－0.073 168C－7.188 75×10－3AB＋3.363 75×10－4AC＋0.010 850BC－2.206 37×10－4A2－0.138 13B2－5.843 00×10－4C2，F(xiàn)＝17.79，P＝0.000 5＜0.05，模型回歸顯著。模型決定系數(shù)R2＝0.958 1，Radj2 ＝0.904 2，CV ＝8.78%，表明方程擬合度好，而F失擬＝22.25，P＝0.005 9＜0.05，失擬性顯著，表明僅以蘿卜苷作為指標，不適合進行響應面設計；芥子堿硫氰酸鹽＝－3.322 67 ＋0.038 021A＋0.191 79B－3.256 25×10－3C－4.950 00×10－4AB＋3.325 00×10－5AC－1.557 50×10－3BC－8.803 12×10－5A2－7.637 50×10－3B2＋4.012 50×10－5C2，F(xiàn)＝7.80，P＝0.006 5 ＜0.05，表明二次多元回歸方程的模型顯著，模型決定系數(shù)R2＝0.909 3，Radj2＝0.792 7，CV ＝2.00%，表明方 程的擬 合度較 好；RS01 ＝＋0.332 64＋2.917 50×10－3A－2.487 50×10－3B－4.062 50×10－4C，模型決定系數(shù)R2＝0.443 8，Radj2＝0.315 5，CV＝5.74%，表明方程的擬合度較差，F(xiàn)＝3.46，P＝0.048 2＞0.05，表明回歸模型不顯著，而且不是多元二次方程，為一次多元方程，沒有交叉項的影響存在。綜上所述，以評價指標的綜合得分進行萊菔子炮制工藝的響應面優(yōu)化具有必要的意義。