江慧敏余欣慧李 赟張源源宣躍廷楊天平

（1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥230000； 2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥230000）

自然流產(chǎn)是指在自然狀態(tài)下非人為因素發(fā)生的流產(chǎn)，目前在我國的發(fā)生率為10%～15%，其中早期自然流產(chǎn)（孕周≤12 周）占比達80% 以上［1］，嚴重影響女性身心健康和今后妊娠［2?3］，其發(fā)病機制尚未完全明確，病因復雜多樣。目前，母胎界面血管新生障礙是國內(nèi)外相關研究的焦點，母胎界面血管修復過程（即母胎界面血管重鑄）從細胞學角度而言，與血管內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的動員、歸巢息息相關，可被人體組織器官所釋放的生長因子、多種細胞因子和激素等物質(zhì)所促進。

組織損傷后，血液會釋放VEGF、SDF?1α 等細胞因子，并通過SDF?1α／CXCR?4 軸使骨髓造血系EPCs 與骨髓間質(zhì)細胞脫離，遷移至外周血［4］，即SDF?1α 參與該動員過程，然后EPCs 順著其濃度進入損傷部位，完成歸巢，表明SDF?1α／CXCR?4 信號轉導通路在胚胎發(fā)育、血管發(fā)育、心臟發(fā)育過程中發(fā)揮著關鍵的作用［5?6］。本實驗通過監(jiān)測腎虛流產(chǎn)小鼠EPCs 動員、歸巢過程，探究補腎安胎合劑對自然流產(chǎn)的影響。

1 材料

1.1 動物 雌性綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）轉基因小鼠6 只（用于活體追蹤的活性骨髓來源干細胞），4 周齡，體質(zhì)量（20±2）g；SPF 級雌性ICR 小鼠100 只（未產(chǎn)），3 周齡，體質(zhì)量（19±2）g；SPF 級雄性ICR 小鼠50 只，3 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，均由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2018?0008，室內(nèi)恒定溫度23～26 ℃，相對濕度40%～45%，在安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院的動物實驗中心進行清潔級標準飼養(yǎng)，自由進食飲水，適應性飼養(yǎng)1 周后無異常后開始實驗。

1.2 藥物 補腎安胎合劑，購自安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（處方組成菟絲子、桑寄生、川斷、熟地等，皖藥制字BZ20080017）；羥基脲，購自齊魯制藥有限公司（國藥準字H37021289）；米非司酮片，購自安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（國藥準字H20033551）。

1.3 試劑 DMEM／F?12 培養(yǎng)基、Phsphate Buffered Saline（1×）、MEM／EBSS、改良型RPMI?1640 培養(yǎng)基，購自美國Hyclone 公司；胎牛血清（FBS），購自德國Sera＆Pro 公司；胰酶Trypsin、DMSO，購自美國Amresco公司；小鼠SDF?1α、CXCR4 ELISA 試劑盒，購自上海科順生物科技有限公司。

1.4 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱，購自日本Sanyo 公司；潔凈工作臺，購自蘇州安泰空氣技術有限公司；生物倒置顯微鏡，購自重慶光電儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡，購自日本Nikon 公司；離心機，購自上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；流式細胞儀，購自美國Beckman 公司；酶標儀，購自美國Bio?Rad 公司；水浴鍋，購自上海一恒科技有限公司；移液器、排槍，購自德國Eppendorf公司。

2 方法

2.1 模型建立

2.1.1 骨髓移植模型 參考文獻［7］ 報道。

2.1.1.1 GFP 轉基因小鼠骨髓單個核細胞的提取、分離、凍存 取6 周左右供體GFP 小鼠，脫臼處死，70%乙醇浸泡5 min，無菌分離供體鼠的股骨和脛骨，PBS 緩沖液沖洗數(shù)次，置于低糖的DMEM中剪碎，反復吹打沖出骨髓，過濾除去組織碎片，離心去上清，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度后接種于培養(yǎng)瓶里。48 h 后換液除去懸浮細胞，每3 d 進行1 次，凍存液將細胞懸浮起來，分裝到凍存管，置于液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.1.2 野生型受體小鼠骨髓移植 采用X 線加速器放射源，對100 只雌性野生型ICR 小鼠全身進行均勻照射，總劑量8.0 Gy，劑量率0.53 Gy／min，放射后2 h 內(nèi)每只受體鼠尾靜脈注射0.1 mL“2.1.1.1”項下單個核細胞懸液。小鼠骨髓重建4周后斷尾取血，保存于肝素鈉采血管中，EDTA 抗凝，樣品在4 ℃冰箱中保存，24 h 內(nèi)用流式細胞儀測定骨髓中GFP 陽性細胞比例，以判斷造模成功與否。

2.1.2 腎虛流產(chǎn)模型 參考文獻［8?9］ 報道。將“2.1.1.2”項下造模成功的雌性小鼠與同種雄性小鼠合籠交配，建立正常妊娠模型，以檢出陰栓者或雌性小鼠陰道內(nèi)見精子者為妊娠第0 天。在妊娠第1～9 天，雌性小鼠灌胃給予450 mg／kg 羥基脲進行造模，在妊娠第10 天上午灌胃給予4.0 mg／kg米非司酮，以復制腎虛流產(chǎn)模型。

2.2 分組與給藥 將40 只“2.1.1.2”項下造模成功、GFP 標記的骨髓移植雌性小鼠隨機分為4組，分別為模型組及中藥低、中、高劑量組，每組10 只，另取10 只GFP 標記的骨髓移植正常小鼠作為空白組，依據(jù)體表面積計算法、補腎安胎合劑臨床應用劑量換算成小鼠給藥劑量。模型組及中藥低、中、高劑量組小鼠分別灌胃給予生理鹽水及3.0、6.0、12.0 g／kg 補腎安胎合劑，而空白組小鼠灌胃給予生理鹽水，各組均連續(xù)給藥4 周。

2.3 小鼠胚胎丟失率檢測 剖視小鼠子宮，觀察胚胎丟失情況，計算胚胎丟失率，公式為丟失率＝［丟失胚胎數(shù)／（丟失胚胎數(shù)＋存活胚胎數(shù)）］×100%。

2.4 EPCs 數(shù)量檢測 處死小鼠，浸泡于75%乙醇中消毒，在超凈臺上無菌分離雙側股骨和脛骨，浸泡于PBS 緩沖液中，反復沖洗骨髓腔，制備骨髓單個核細胞懸液，采用流式細胞術檢測。采集經(jīng)肝素鈉抗凝的外周血，直接采用流式細胞術檢測。蛻膜組織用PBS 緩沖液沖洗數(shù)次，制備單細胞懸液后，經(jīng)流式細胞儀檢測GFP、Flk?1、Sca?1 陽性細胞占單核細胞的比例，通過Cell Quest 軟件分析單個核細胞中GFP＋／Flk?1＋／Sca?1＋的EPCs 占比。

2.5 外周血SDF?1α 水平及蛻膜組織CXCR?4 表達檢測 小鼠外周血離心后取上清液，采用ELISA法檢測SDF?1α 水平。將蛻膜組織制成混懸液后，采用ELISA 法檢測蛻膜組織CXCR?4 表達。

2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，所有數(shù)據(jù)均先進行正態(tài)性檢驗，2 組間比較采取獨立樣本t檢驗，3 組及3組以上之間比較采取方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 GFP 骨髓嵌合率檢測 如圖1 所示，小鼠骨髓單個核細胞的GFP 陽性率為94.2%。骨髓移植后，小鼠死亡6 只，采用流式細胞儀測定其骨髓中GFP 陽性細胞比例，發(fā)現(xiàn)44 只造模失敗，50 只造模成功，成功率為53.2%。

圖1 骨髓移植小鼠GFP 陽性率Fig.1 GFP positive rates in bone marrow transplantation mice

3.2 小鼠胚胎丟失率 如表1 所示，空白組小鼠胚胎丟失率低于模型組、中藥低劑量組（P＜0.01）；模型組小鼠胚胎丟失率高于中藥各劑量組（P＜0.05，P＜0.01）；與中藥高劑量組比較，中藥低劑量組小鼠胚胎丟失率升高（P＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組小鼠胚胎丟失率降低（P＜0.05）。

表1 各組小鼠流產(chǎn)率及胚胎丟失率比較（， n＝10）Tab.1 Comparison of abortion rates and embryo loss rates of mice among various groups（， n ＝10）

表1 各組小鼠流產(chǎn)率及胚胎丟失率比較（， n＝10）Tab.1 Comparison of abortion rates and embryo loss rates of mice among various groups（， n ＝10）

注：與空白組比較，■■P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與中藥高劑量組比較，●P ＜0.05；與中藥低劑量組比較，★P＜0.05。

3.3 小鼠骨髓EPCs 數(shù)量 如表2、圖2 所示，與空白組比較，模型組、中藥各劑量組小鼠骨髓EPCs 數(shù)量降低（P＜0.01）；與模型組比較，中藥高劑量組小鼠骨髓EPCs 數(shù)量升高（P＜0.01）；與中藥高劑量組比較，中藥中、低劑量組小鼠骨髓EPCs 數(shù)量降低（P＜0.01）。

圖2 小鼠骨髓流式細胞檢測Fig.2 Detection of bone marrow of mice by flow cytometry

表2 各組小鼠骨髓EPCs 數(shù)量比較（， n＝10）Tab.2 Comparison of EPCs counts in bone marrow of mice among various groups（， n＝10）

表2 各組小鼠骨髓EPCs 數(shù)量比較（， n＝10）Tab.2 Comparison of EPCs counts in bone marrow of mice among various groups（， n＝10）

注：與空白組比較，■■P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與中藥高劑量組比較，●●P＜0.01。

3.4 小鼠外周血EPCs 數(shù)量 如表3 所示，與空白組比較，模型組、中藥各劑量組小鼠外周血EPCs 數(shù)量降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組小鼠外周血EPCs 數(shù)量升高（P＜0.01）。

表3 各組小鼠外周血EPCs 數(shù)量比較（， n＝10）Tab.3 Comparison of EPCs counts in peripheral blood of mice among various groups（， n＝10）

表3 各組小鼠外周血EPCs 數(shù)量比較（， n＝10）Tab.3 Comparison of EPCs counts in peripheral blood of mice among various groups（， n＝10）

注：與空白組比較，■P ＜0.05，■■P ＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

3.5 小鼠蛻膜組織EPCs 數(shù)量 如表4 所示，與空白組比較，模型組、中藥各劑量組小鼠蛻膜組織EPCs 數(shù)量降低（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組小鼠蛻膜組織EPCs 數(shù)量升高（P＜0.05，P＜0.01）；與中藥高劑量組比較，中藥低、中劑量組小鼠蛻膜組織EPCs 數(shù)量降低（P＜0.05，P＜0.01）；與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組小鼠蛻膜組織EPCs 數(shù)量升高（P＜0.05）。

表4 各組小鼠蛻膜組織EPCs 數(shù)量比較（， n＝10）Tab.4 Comparison of EPCs counts in decidual tissue of mice among various groups（， n＝10）

表4 各組小鼠蛻膜組織EPCs 數(shù)量比較（， n＝10）Tab.4 Comparison of EPCs counts in decidual tissue of mice among various groups（， n＝10）

注：與空白組比較，■■P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與中藥高劑量組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01；與中藥低劑量組比較，★P＜0.05。

3.6 小鼠外周血SDF?1α 水平、蛻膜組織CXCR?4表達 如圖3 所示，空白組小鼠外周血SDF?1α 水平高于模型組及中藥低、中劑量組（P＜0.05，P＜0.01）；模型組小鼠外周血SDF?1α 水平低于中藥各劑量組（P＜0.01）；中藥低劑量組小鼠外周血SDF?1α 水平低于中藥中、高劑量組（P＜0.05）。與空白組比較，模型組小鼠蛻膜組織CXCR?4 表達低于中藥各劑量組（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組小鼠蛻膜組織CXCR?4 表達升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 各組小鼠外周血SDF?1α 水平、蛻膜組織CXCR?4 表達Fig.3 SDF?1α levels in peripheral blood and CXCR?4 expressions in decidual tissue of mice in various groups

4 討論

自然流產(chǎn)在中醫(yī)角度屬“胎漏”“胎動不安”“滑胎”“墮胎”“小產(chǎn)”范疇。歷代醫(yī)家多認為該病以腎虛為本，加之后天外感六淫，內(nèi)傷七情等病因多造成脾的功能失司。腎氣不足，不能維系胞脈，以致胎失所系；脾氣虧虛，不能充養(yǎng)胞脈，以致胎失所養(yǎng)，二者相互影響，導致胎元不固。因此胞胎難以維系在于脾腎不足所致胞脈不系不充之病。胞脈為隸屬于胞宮之血脈，胞絡為絡屬于胞宮的脈絡，胞宮通過胞脈、胞絡與其他臟腑相聯(lián)系，它們將匯聚于沖任二脈的陰血下注與胞宮，并與足少陰腎經(jīng)發(fā)生經(jīng)絡上的聯(lián)系。胞脈是絡脈的組成部分，絡脈將一身氣血灌溉到臟腑組織內(nèi)，是維持人體生命活動、保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的網(wǎng)絡結構［10］。中醫(yī)的絡脈較西醫(yī)的血管功能更甚，絡脈之血絡的功能與西醫(yī)微血管類似。因此，從血管角度研究中醫(yī)藥防治自然流產(chǎn)成為目前的研究熱點。

從現(xiàn)代醫(yī)學角度，由血管新生促進的母胎界面血管重鑄是妊娠維持的關鍵［11］。EPCs 在維持母體血管系統(tǒng)功能穩(wěn)定及子宮胎盤形成過程中發(fā)揮重要作用，其可以通過動員、歸巢影響自然流產(chǎn)母胎界面血管重鑄［12］。在生理狀態(tài)下，骨髓EPCs 處于靜息狀態(tài)。當存在各種外源性或內(nèi)源性因素干預骨髓局部的微環(huán)境時，會誘導干細胞穿過竇狀內(nèi)皮離開骨髓進入血流。該動員過程，將EPCs 由骨髓轉移至外周血，增強代償性血管重建。研究表明，外周中SDF?1α表達上調(diào)可誘導EPCs動員［13?14］。當EPCs 動員到外周循環(huán)血中后，血管損傷部位產(chǎn)生釋放趨化因子如VEGF、SDF?1α，分別與EPCs 表面表達的受體VEGFR?2 及CXCR?4 相結合，EPCs順趨化因子梯度濃度趨化到內(nèi)皮損傷部位或組織缺血部位；趨化過程完成后，EPCs 遷移至內(nèi)皮細胞表面，侵襲入內(nèi)皮下基質(zhì)完成內(nèi)皮修復。由此可見，SDF?1a 誘導的EPCs 動員和歸巢可能在母胎界面血管重鑄過程中扮演了重要角色。

補腎安胎合劑是我院的院內(nèi)制劑，為壽胎丸加減而成，具有補腎健脾、益氣安胎的作用，唯有腎氣足、脾氣充方能使沖任匯聚精血于胞宮、胞脈，使胎元穩(wěn)固，與現(xiàn)代醫(yī)學中，促進母胎界面血管生成有異曲同工之妙。我們既往已有制備腎虛流產(chǎn)模型進行研究，結果顯示流產(chǎn)大鼠母胎界面胰島素樣生長因子?1（IGF?1）與血管內(nèi)皮因子VEGF 表達呈正相關，補腎安胎沖劑可以上調(diào)腎虛流產(chǎn)大鼠蛻膜IGF?1 和VEGF 表達［15］。郝樂樂等［16］通過復制正常妊娠模型、復發(fā)性流產(chǎn)模型后進行分組研究，結果顯示補腎安胎沖劑可通過調(diào)控VHL／HIF?1α 信號通路改善復發(fā)性流產(chǎn)小鼠母胎界面血管生成，從而降低流產(chǎn)率。本實驗在既往研究基礎上，著重對內(nèi)皮祖細胞動員、歸巢的研究，由實驗結果可知：補腎安胎合劑可提高骨髓、外周血、蛻膜組織中EPCs 數(shù)目，其可能的機制與上調(diào)外周血SDF?1α水平與蛻膜組織中CXCR?4 表達有關。即補腎安胎合劑可通過促進骨髓EPCs 的動員、誘導EPCs 歸巢至母胎界面缺血部位，從而起到防治流產(chǎn)的發(fā)生，驗證了中醫(yī)“胞脈系于腎”“腎主骨生髓”、自然流產(chǎn)“從脾腎論治”的科學內(nèi)涵。