張孟孟芮雪琳楊 曄徐 莉尹登科

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012； 2.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230012；3.現(xiàn)代中藥研究與開發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230012）

排膿散源自《金匱要略》，由枳實(shí)、芍藥、桔梗3 味中藥按5 ∶5 ∶2 的比例配伍組成［1］，具有排膿化毒、調(diào)理氣血、止痛等功效［2?3］，可用于腸癰、瘡癰等多種膿腫性疾病的治療［4］。現(xiàn)代病理實(shí)驗(yàn)證明，該方對醋酸所致急性炎癥小鼠模型具有明顯的抗炎作用［5］，但機(jī)制仍未明確。

結(jié)腸癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，具有預(yù)后效果差、反復(fù)發(fā)作、高死亡率等特點(diǎn)［6?8］。近年來臨床研究表明，炎癥性腸病與結(jié)腸癌的發(fā)病率高度相關(guān)［9］，阻斷結(jié)腸炎癥向結(jié)腸癌演變是結(jié)腸癌二級預(yù)防的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)旨在研究排膿散對致癌劑氧化偶氮甲烷和誘導(dǎo)劑葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)結(jié)腸癌小鼠的抗腫瘤作用，以期為該方臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 氧化偶氮甲烷（美國Sigma 公司）；葡聚糖硫酸鈉（相對分子質(zhì)量36 000～50 000，中國大連美倫生物科技有限公司）。阿司匹林腸溶片（中國石家莊康力藥業(yè)有限公司）。枳實(shí)、白芍、桔梗由安徽合肥當(dāng)?shù)刂兴幉氖袌鎏峁?，?jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金教授鑒定為正品。IL?4、IFN?γ 兔抗鼠多克隆抗體（北京博奧森生物工程有限公司）；IL?6、TNF?α 兔抗鼠多克隆抗體（沈陽萬類生物工程有限公司）。其余試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器 DM2000 熒光顯微鏡（德國Leica 公司）；Milli?Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

1.3 動(dòng)物 雄性Balb／c 小鼠（20±2）g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（皖）2017?001。實(shí)驗(yàn)開始前，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

2 方法

2.1 排膿散提取物制備 稱取120 g 組方藥材（枳實(shí)、白芍、桔梗比例為5 ∶5 ∶2），加入10 倍量超純水浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮30 min，過濾得一煎煎煮液；二煎加入8 倍量水，武火煮沸，文火煎煮25 min，過濾得二煎煎煮液，合并2 次煎煮液，濃縮至75 mL，即得，－20 ℃下保存待用。

2.2 分組與造模 32 只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、陽性藥（阿司匹林）組、排膿散組，每組8只。其中，模型組小鼠于實(shí)驗(yàn)開始第1 天將腹腔注射10 mg／kg 氧化偶氮甲烷，于第8～14、29～35、50～56 天攝取含2.5%葡聚糖硫酸鈉的飲用水，以建立結(jié)腸癌模型。

2.3 給藥 從實(shí)驗(yàn)第8 天起直至造模結(jié)束，小鼠每天灌胃給藥。臨床上，排膿散給藥劑量為12 g 生藥／70 kg，阿司匹林為0.1 g／70 kg，按照小鼠給藥劑量換算方法［10］，排膿散組、陽性藥組小鼠給藥劑量分別為1.6 g 生藥／kg、13 mg／kg，而對照組、模型組灌胃給予相同容量的超純水，每周稱量體質(zhì)量。給藥結(jié)束后，收集小鼠結(jié)腸組織，測量長度，統(tǒng)計(jì)腫瘤數(shù)目，見圖1。

圖1 結(jié)腸癌小鼠模型建立方法Fig.1 Establishment method of colon cancer mouse model

2.4 免疫組化實(shí)驗(yàn) 小鼠腸組織石蠟切片后常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，PBS 緩沖液漂洗，在95 ℃10 mmol／L 枸櫞酸鈉溶液中修復(fù)20 min，冷卻至室溫，加入過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10 min，PBS 緩沖液漂洗，加入山羊血清，37 ℃下孵育20 min，傾去血清（無需洗滌），分別滴加兔抗IL?4、IL?6、TNF?α、IFN?γ（均為1 ∶200 比例稀釋），4 ℃下孵育過夜，TBST 緩沖液漂洗，滴加適量辣根酶標(biāo)山羊抗兔IgG 聚合物，37 ℃下孵育30 min，TBST 緩沖液漂洗，DAB 顯色1 min，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水透化，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。每張切片隨機(jī)選取6 個(gè)視野（×200），采用Image?J 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，記錄積分光密度（IOD）值。

2.5 蘇木精?伊紅（HE）染色 小鼠腸組織石蠟切片后常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色3 min，流水沖洗1 min，1%鹽酸乙醇分化5 s，流水沖洗1 min，返藍(lán)，伊紅染色15 s，流水沖洗1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透化，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。每張切片隨機(jī)選取6 個(gè)視野（×200）觀察。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 排膿散對小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長度及腫瘤個(gè)數(shù)的影響 與對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量降低，結(jié)腸長度縮短（P＜0.01）；與模型組比較，排膿散組小鼠腫瘤個(gè)數(shù)減少（P＜0.01），并具有抑制體質(zhì)量下降趨勢和結(jié)腸縮短的作用（P＜0.01），見圖2。

圖2 排膿散對小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長度、腫瘤個(gè)數(shù)的影響Fig.2 Effects of Painong Powder on body weight，colon length and tumor number of mice

3.2 小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài) 除對照組外，各組小鼠都觀察到炎性細(xì)胞浸潤。與對照組比較，模型組小鼠隱窩扭曲膿腫、淋巴細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，腺體不典型增生，并可見異樣結(jié)構(gòu)；陽性藥組小鼠顯示出炎癥狀態(tài)，隱窩破壞，微絨毛缺失，炎癥細(xì)胞浸潤，腺體排布紊亂；排膿散組小鼠顯示輕微的前炎癥狀態(tài)，腸隱窩變淺，微絨毛數(shù)量減少并變短，見圖3。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)Fig.3 Pathological morphologies of colon tissues of mice in various groups

3.3 排膿散對小鼠結(jié)腸組織IL?6、TNF?α、IL?4、IFN?γ 蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織IL?6、TNF?α蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，排膿散組小鼠結(jié)腸組織IL?6、TNF?α 蛋白表達(dá)升高降低（P＜0.01），見圖4。

圖4 排膿散對小鼠結(jié)腸組織IL?6、TNF?α 蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Painong Powder on the protein expressions of IL?6 and TNF?α in colon tissues of mice

與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織IL?4、IFN?γ 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，排膿散組小鼠結(jié)腸組織IL?4、IFN?γ 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），見圖5。

圖5 排膿散對小鼠結(jié)腸組織IL?4、IFN?γ 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Painong Powder on the protein expressions of IL?4 and IFN?γ in colon tissues of mice

4 討論

腸道的慢性炎癥是結(jié)直腸癌發(fā)生的主要原因之一，因此阻止結(jié)腸炎向結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)變是防治結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌的一個(gè)重要手段［11］。中藥復(fù)方排膿散由枳實(shí)、芍藥、桔梗3 味中藥組成，配比精簡，廣泛應(yīng)用于瘡癰、腸癰等癥的治療。本研究考察了排膿散對結(jié)腸炎誘導(dǎo)的結(jié)腸癌的治療作用，排膿散能夠顯著緩解經(jīng)AOM／DSS 誘導(dǎo)建立的小鼠結(jié)腸癌模型體質(zhì)量下降趨勢，并抑制結(jié)腸長度縮短和模型小鼠的結(jié)腸腫瘤生長，證實(shí)排膿散對AOM／DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸癌有明顯的改善作用。

炎癥因子表達(dá)失衡在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，通過對結(jié)腸組織進(jìn)行免疫組化染色和光密度值計(jì)算發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織IL?6 及TNF?α 表達(dá)水平升高，IL?4 及IFN?γ 表達(dá)水平降低；而排膿散給藥組中，上述指標(biāo)均出現(xiàn)明顯逆轉(zhuǎn)趨勢。IL?6 及TNF?α 是腫瘤微環(huán)境中重要的促炎因子，AOM／DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸癌小鼠血清中往往IL?6 水平較高［11?13］，而TNF?α 可以誘導(dǎo)靶細(xì)胞DNA 突變、惡性轉(zhuǎn)化、細(xì)胞增殖以及血管增生，同時(shí)與腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［14］。相反，炎性細(xì)胞分泌的抑炎細(xì)胞因子包括IL?4、IL?10 等則能夠抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生［15］。IFN?γ 是具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)的淋巴因子，具有誘導(dǎo)機(jī)體抗病毒狀態(tài)、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用［16］。因此，排膿散可能是通過改善結(jié)腸組織中促炎因子與抗炎因子的表達(dá)水平，從而抑制結(jié)腸炎小鼠炎癌轉(zhuǎn)變的進(jìn)程。