王晶 姜曉洪 劉艷 劉歡

先天性耳聾是嬰兒出生時(shí)因基因遺傳及環(huán)境因素(如創(chuàng)傷、醫(yī)療、藥物等)造成的聽力感覺障礙缺陷,約占我國新生兒出生總數(shù)的0.15%［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì),遺傳性基因突變因素約占總因素的60%,目前世界上已確定的與出生相關(guān)的耳聾基因突變64 個(gè),突變位點(diǎn)125 個(gè)［2］,在我國,常見的耳聾基因突變包括GJB2、線粒體基因等,基因突變會(huì)造成新生兒聽力不同程度的異常,如高頻音域、重度感音等的不敏感［3］。在嬰兒出生時(shí)即對耳聾進(jìn)行篩查,對先天性耳聾的早期診斷和干預(yù)意義重大。而臨床發(fā)現(xiàn),先天性耳聾具有癥狀遲發(fā)的特點(diǎn),即出生早期表現(xiàn)不出來,而在其后的生長發(fā)育期間逐漸顯露,因此,單純依靠純音測聽儀器進(jìn)行聽力檢測無法真實(shí)的檢測出全部先天性耳聾情況［4］；且純音聽力測試需要推遲到新生兒出生后3 個(gè)月進(jìn)行復(fù)查,才能最終確診,前后共需要最多達(dá)到6個(gè)月時(shí)間。采用基因檢測對致病位點(diǎn)進(jìn)行基因分析,是現(xiàn)階段先天性耳聾篩查的重要擴(kuò)展手段,能彌補(bǔ)純音檢查的局限性,減少假陰率,且具有簡單快捷、準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)。本研究對錫林郭勒盟地區(qū)的新生兒進(jìn)行了基因篩查,以探討耳聾基因的篩查結(jié)果及篩查方法的應(yīng)用,并了解耳聾基因在不同地區(qū)的基因分布特征,以作為先天性耳聾發(fā)現(xiàn)和干預(yù)的臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟地區(qū)2018～2019 年新出生的592 例新生兒作為研究對象,其中男304 例,女288 例；胎齡32～40 周,平均胎齡(38.2±5.5)周；出生體重2.5～4.6 kg,平均出生體重(3.2±0.8)kg；順產(chǎn)256 例,剖宮產(chǎn)336 例。新生兒家屬均在充分了解基因篩查的基礎(chǔ)上簽署同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①新生兒臨床資料完整；②新生兒家屬同意本次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①新生兒在母胎孕期異常；②早產(chǎn)兒；③智障患兒；④出生時(shí)合并腦膜炎或中耳炎；⑤其他遺傳性疾病。

1.2方法

1.2.1工具與材料 使用全血核酸提取試劑盒對所有新生兒DNA 進(jìn)行提取,用耳聾基因檢測試劑盒和核酸分子雜交儀對新生兒突變基因進(jìn)行檢測,使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增儀作為輔助［5］。

1.2.2DNA 的提取和基因檢測 在新生兒出生3 d 內(nèi)采集期靜脈血3 ml,送至實(shí)驗(yàn)室,經(jīng)試劑盒提取DNA后監(jiān)測DNA 質(zhì)量濃度、DNA 純度,方法可以采用紫外分光光度法,確保濃度≥200 ng/L,純度A260 與A280比值范圍為1.8～2.0。將提取后的DNA 冷藏備用,采用PCR+導(dǎo)流雜交法,依照耳聾基因易感測試盒的操作說明,測試耳聾基因常見的13 個(gè)突變點(diǎn)。PCR 增擴(kuò)：取適量PCR 增擴(kuò)引物混合物與PCR 增擴(kuò)試劑混合物,經(jīng)過：10 min 37 ℃,15 min 95℃,1 min 96℃,30 s 94℃,30 s 55 ℃,45 s 70℃,總共經(jīng)歷32 個(gè)循環(huán),最后以10 min 60℃處理后在4℃下保存。雜交過程：事前將雜交儀以雜交程序預(yù)熱30 min 以上,溫度設(shè)定為50℃。將增擴(kuò)后的PCR 產(chǎn)物給以5 min 95℃變性之后冰浴冷卻3 min,從增擴(kuò)管中取PCR 產(chǎn)物與雜交緩沖液混合并經(jīng)瞬時(shí)離心,將低密度芯片探針與混合液雜交,通過顯色反應(yīng),得到最終結(jié)果。

1.3質(zhì)量控制 參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27043-2012/ISO/IEC 17043：2010 合格評定能力［6］驗(yàn)證通用要求執(zhí)行。

1.4觀察指標(biāo) 分析錫林郭勒盟地區(qū)新生兒基因攜帶情況分析及其分布情況。統(tǒng)計(jì)我國人種中常見的4 種耳聾易感基因和13 個(gè)常見突變位點(diǎn),包括：①GJB2基因,熱點(diǎn)突變位點(diǎn)為35delG、176del16、235delC、299delAT、155delTCTG；②SLC26A4 基因,熱點(diǎn)突變位點(diǎn)為IVS7-2A＞G、2168A＞G、1229C＞T；③GBJ3 基因,熱點(diǎn)突變位點(diǎn)為538C＞T；④線粒體12Sr RNA 基因,熱點(diǎn)突變點(diǎn)為1494C＞T、1555A＞G、7445A＞G、12201T＞C。

2 結(jié)果

2.1新生兒耳聾基因攜帶情況分析 592 例新生兒中共發(fā)現(xiàn)耳聾基因攜帶者32 例,占比為5.41%；突變基因中GJB2 基因14 例,占總例數(shù)的2.36%；SLC26A4基因10 例,占總例數(shù)的1.69%；GJB3 基因4 例,占總例數(shù)的0.68%；線粒體12SrRNA 基因4 例,占總例數(shù)的0.68%。見表1。

表1 新生兒耳聾基因攜帶情況分析 (n,%)

2.2新生兒基因位點(diǎn)分布情況 新生兒檢出最多的突變位點(diǎn)是GJB2 的235delC 和SLC26A4 的IVS7-2A＞G突變,分別占總例數(shù)的1.18%(7/592)和0.84%(5/592),其余依次為GJB2 的176del16 雜合突變和GBJ3 的538C＞T 雜合突變,均占總例數(shù)的0.68%(4/592)。

3 討論

先天性耳聾是新生兒出生缺陷的一種,遺傳因素在先天性耳聾原因中占有相當(dāng)大的比例,因此遺傳性耳聾越來越受到國內(nèi)外學(xué)術(shù)研究的重視,先天性耳聾篩選的基因檢測工作也逐漸展開。通過比對目前國際上已發(fā)現(xiàn)的耳聾基因,從而可以掌握新生兒基因的突變情況,并以此斷定新生兒是否患有先天性耳聾。

新生兒先天性耳聾基因因地域及人種不同而不同,有研究指出,中國新生兒遺傳性耳聾主要與GJB2、SLC26A4、GJB3 及線粒體基因相關(guān),但各地區(qū)報(bào)道的新生兒基因突變比例有較大差異［7］。方炳雄等［8］的研究中對粵東地區(qū)1430 例新生兒展開耳聾基因突變調(diào)查,發(fā)現(xiàn)陽性檢出率為3.85%。楊曉等［9］在西北地區(qū)新生兒遺傳性耳聾篩查中發(fā)現(xiàn),751 例中出現(xiàn)基因突變39 例,陽性檢出率為5.18%。本次研究中,在對592 例新生兒耳聾篩查中發(fā)現(xiàn)基因突變新生兒32 例,占比為5.41%,與西北地區(qū)調(diào)查較為接近,而檢出率高于粵東地區(qū),這顯示出遺傳性耳聾基因突變的地域相關(guān)性。

本次研究中4 種基因突變率與前述研究有一定的差別,同樣體現(xiàn)了基因突變的地域性。GJB2 的突變不會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損害,患者聽覺相關(guān)神經(jīng)中樞完整,但GJB2 基因突變能引起連接蛋白異常,進(jìn)而影響細(xì)胞間隙,對聽覺的影響程度與突變位點(diǎn)相關(guān)［10］,235delC雜合突變是常見的截?cái)嘈酝蛔?在本次研究中發(fā)生率為1.18%,能造成新生兒重度、極重度感音性耳聾。盡管耳聾基因的攜帶對于新生兒認(rèn)知、閱讀能力的提高沒有直接關(guān)系,但聽力障礙會(huì)極大的影響兒童語言學(xué)習(xí)、交流能力的培養(yǎng),如果不進(jìn)行有效干預(yù),新生兒極有可能發(fā)展成為聾啞人,造成終生遺憾。盡管后天的教育能夠彌補(bǔ)耳聾帶來的缺憾,但該問題的終極解決方案仍在于盡早診斷和發(fā)現(xiàn)患兒攜帶耳聾基因,并提前做好準(zhǔn)備,在發(fā)現(xiàn)患兒聽力下降后,幫助其安裝人工耳蝸恢復(fù)其聽力,才不會(huì)錯(cuò)過生長發(fā)育階段而造成終生缺憾。

SLC26A4 基因較為常見的突變位點(diǎn)是IVS7-2A＞G,在本例研究中共發(fā)現(xiàn)5 例,發(fā)生率為0.84%,該位點(diǎn)的突變能造成新生兒遲發(fā)性非綜合耳聾,患兒在出生時(shí)表現(xiàn)出聽力正常,但在隨后的生長發(fā)育過程中因創(chuàng)傷、碰撞、驚嚇、噪音等因素會(huì)出現(xiàn)聽力突然下降,俗稱“一巴掌致聾”。對這部分致聾患者應(yīng)提高告知耳聾的風(fēng)險(xiǎn),生活中避免劇烈活動(dòng),防止腦外傷形成,延緩耳聾的發(fā)生。如聽力突然下降,則有可能是該基因致病,可佩帶助聽器獲得適量的聽力補(bǔ)償,或安裝人工耳蝸助其恢復(fù)聽力。GJB3 基因突變攜帶者也屬于遲發(fā)性耳聾,患兒青少年時(shí)期聽力正常,但到青壯年時(shí)期出現(xiàn)聽力明顯下降,主要體現(xiàn)在對高頻感音的不敏感。本次研究中檢測出4 例線粒體12S rRNA 基因的1555A＞G 位點(diǎn)均質(zhì)突變和雜合突變,該基因攜帶者與患兒出現(xiàn)遲發(fā)性或藥物性耳聾相關(guān),該類型的攜帶者需要注意抗生素的使用,因?yàn)榭赡芤鸹純撼霈F(xiàn)藥物致病耳聾。

相比單純的聽力篩查,耳聾基因檢測有其優(yōu)越性,其除了能篩查出先天性耳聾患兒,更為重要的是能篩查出遲發(fā)性及藥物敏感性耳聾基因攜帶者,這是純音聽力檢查無法檢測出的。但同時(shí)耳聾基因檢測也有其弱勢,即檢測不出創(chuàng)傷性、化學(xué)藥物性、醫(yī)療或妊娠引起的非遺傳性耳聾,因此耳聾基因檢測必須與純音聽力篩查同步進(jìn)行,互為補(bǔ)充,盡早發(fā)現(xiàn)潛在的耳聾新生兒,并及時(shí)向其父母展開健康宣教,減少新生兒在生長發(fā)育過程中耳聾的發(fā)生及由耳聾帶來的負(fù)面影響,并盡早開展人工耳蝸等輔助措施,助其獲得正常聽力?；驒z測的意義不僅在于篩選出攜帶耳聾基因的患者,更在于基于父母的基因類型,推斷出其后代攜帶耳聾基因的幾率,從而對家庭的婚育起到指導(dǎo)作用,避免攜帶耳聾基因新生兒的出生。對于有耳聾家族史或本身已患耳聾的育齡夫婦應(yīng)該重點(diǎn)接受耳聾基因的檢測,以盡早對于后代攜帶有耳聾基因做好準(zhǔn)備。對于同種類型耳聾基因攜帶的妊娠期夫婦進(jìn)行產(chǎn)前耳聾基因檢測非常有必要,可以提早識別出胎兒是否攜帶耳聾基因,并據(jù)此作出是否終止妊娠的決定。

綜上所述,耳聾基因檢測是新生兒耳聾篩查的重要工具,能篩查出遲發(fā)性耳聾患兒基因攜帶者,是早期發(fā)現(xiàn)患兒聽力障礙的重要補(bǔ)充。對新生兒進(jìn)行基因檢測和篩查,能夠盡早發(fā)現(xiàn)耳聾突變基因攜帶者,早診斷、早干預(yù),明確病因、合理用藥治療,從而減少耳聾的發(fā)生。