佟昕琪，于 鳴，王 泓，張媛欣，婁喜瑩，萬(wàn) 朋

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

近年來(lái)，因過(guò)度飲酒造成的事故、損傷、疾病和死亡等問(wèn)題顯著增加。酒精依賴是一種以酒精耐受、依賴、飲酒、自控力進(jìn)行性喪失和以戒斷綜合征為特點(diǎn)的慢性功能紊亂性疾病[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是酒精最敏感的靶點(diǎn)。酒精可以自由通過(guò)血腦屏障，影響神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能。酒精主要影響中腦黑質(zhì)-紋狀體多巴胺系統(tǒng)功能異常，從而導(dǎo)致記憶能力障礙、失眠、抑郁、異動(dòng)癥、成癮、焦慮，甚至產(chǎn)生幻想等行為[2]。有研究證實(shí)，酒精可以損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[3]。目前關(guān)于酒精對(duì)機(jī)體損傷的研究較多，主要包括對(duì)大腦的結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)及受體等[4]，但酒精自由飲對(duì)大鼠的異動(dòng)行為研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)采用酒精自由飲模型，觀察酒精對(duì)大鼠異動(dòng)行為和學(xué)習(xí)記憶能力的影響，同時(shí)檢測(cè)血清中自由基的損傷情況，探討酒精損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性清潔級(jí)SD大鼠32只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫(20±2)℃，相對(duì)濕度40%～60%，體重(200±20)g，吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-吉2016—0003)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4個(gè)組，對(duì)照組及酒精自由飲6%、8%、12%的濃度梯度組。

1.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)大鼠在新異環(huán)境中的自主行為。檢測(cè)前1 d大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)適應(yīng)30 min以熟悉環(huán)境。觀察指標(biāo)有大鼠排尿、排便次數(shù)，運(yùn)動(dòng)速度，運(yùn)動(dòng)距離(水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng))，休息時(shí)間，沿邊運(yùn)動(dòng)距離和中央運(yùn)動(dòng)距離及停留的時(shí)間等。本實(shí)驗(yàn)主要觀察大鼠水平運(yùn)動(dòng)的時(shí)間和距離以及垂直運(yùn)動(dòng)的時(shí)間和距離，每次測(cè)試時(shí)間30 min。每測(cè)試一次動(dòng)物都要對(duì)曠箱地板進(jìn)行75%酒精擦拭，以免上次動(dòng)物余留的信息(如動(dòng)物的大、小便，氣味)影響下次測(cè)試結(jié)果。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。檢測(cè)前1 d大鼠在無(wú)站臺(tái)的水池中自由游泳2 min以熟悉環(huán)境。定位航行實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)有大鼠尋找并跳上平臺(tái)的時(shí)間、路徑、總路程以及搜索策略方式等。本實(shí)驗(yàn)用逃避潛伏期以120 s記錄?？臻g探索實(shí)驗(yàn)用來(lái)衡量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)平臺(tái)所處空間位置的記憶保持能力，測(cè)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在固定的時(shí)間內(nèi)(本實(shí)驗(yàn)采用60 s)穿越原站臺(tái)區(qū)的次數(shù)。

1.4 海馬組織多巴胺含量及血清中抗氧化指標(biāo)測(cè)定

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠行腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3000 r/min(離心半徑13.5 cm)，離心10 min，制備血清，樣本用于測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量(嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作)。之后快速在冰上取腦，并迅速剝離一側(cè)大腦海馬組織，濾紙濾干準(zhǔn)確稱取海馬組織的重量，并放入盛有腦組織質(zhì)量9倍4 ℃生理鹽水的組織勻漿管中，用勻漿器制備10%的組織勻漿，3000 r/min(離心半徑13.5 cm)，離心10 min，取上清液備用。將收集的樣品注入高效液相色譜系統(tǒng)，測(cè)定多巴胺(dopamine，DA)的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，8%、12%酒精組大鼠水平運(yùn)動(dòng)的時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；12%酒精組與6%酒精組相比，大鼠水平運(yùn)動(dòng)的時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；12%酒精組與對(duì)照組和6%酒精組相比，大鼠水平運(yùn)動(dòng)的距離顯著增加(P<0.05)。與對(duì)照組相比，8%、12%酒精組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)的時(shí)間和垂直運(yùn)動(dòng)的距離均顯著減少(P<0.05)；12%酒精組與6%酒精組相比大鼠垂直運(yùn)動(dòng)的時(shí)間和垂直運(yùn)動(dòng)的距離均顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 酒精自由飲對(duì)大鼠自主行為的影響

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)中，大鼠找到站臺(tái)所需要的時(shí)間，即逃避潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加逐漸縮短。與對(duì)照組相比，8%、12%酒精組大鼠的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，12%酒精組與6%酒精組相比大鼠的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05)。第5天撤去站臺(tái)后的空間探索實(shí)驗(yàn)中，大鼠在60 s內(nèi)穿過(guò)原站臺(tái)區(qū)的次數(shù)與對(duì)照組相比，8%、12%酒精組大鼠穿越原站臺(tái)的次數(shù)顯著減少(P<0.05)；12%酒精組與6%酒精組相比大鼠穿越原站臺(tái)的次數(shù)顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 酒精自由飲對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.3 酒精對(duì)海馬組織DA含量及血清中SOD和MDA的影響

與對(duì)照組相比，8%、12%酒精組大鼠海馬組織內(nèi)DA含量顯著減少(P<0.05)；12%酒精組與6%酒精組相比大鼠海馬組織內(nèi)DA含量顯著減少(P<0.05)。與對(duì)照組相比，8%、12%酒精組大鼠血清中SOD的活性顯著降低(P<0.05)；12%酒精組與6%酒精組相比大鼠血清中SOD的活性顯著降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比，8%、12%酒精組大鼠血清中MDA含量顯著增加(P<0.05)；12%酒精組與6%酒精組相比大鼠血清中MDA含量顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 酒精對(duì)海馬組織DA含量及血清中SOD活性和MDA含量影響

3 討 論

眾所周知，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是酒精損傷的重要靶點(diǎn)之一，攝入酒精后可損傷大腦神經(jīng)元的形態(tài)及其功能發(fā)生改變。有研究證實(shí)，長(zhǎng)期過(guò)量飲酒可以引起明顯的酒精依賴，最終引起嚴(yán)重的遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙，其運(yùn)動(dòng)障礙發(fā)生在戒斷期與短暫性帕金森病相類似[5]。本研究證實(shí)，8%、12%的酒精濃度組大鼠海馬組織內(nèi)DA含量顯著減少，并且在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了垂直運(yùn)動(dòng)的時(shí)間和垂直運(yùn)動(dòng)的距離均顯著減少的異動(dòng)癥狀。研究證實(shí)，多巴胺能神經(jīng)元及其受體在藥物成癮中發(fā)揮重要作用，中腦黑質(zhì)及紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元減少引起顯著的帕金森病特征[6]。雖然海馬不是多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)的經(jīng)典部位，但是海馬接受腹側(cè)背蓋區(qū)等處的多巴胺能神經(jīng)元的投射[7-8]，而且海馬內(nèi)有D1和D2受體的高表達(dá)[9]。長(zhǎng)期過(guò)量飲酒最常表現(xiàn)為Korsakoff綜合征和酒精相關(guān)性癡呆，長(zhǎng)期過(guò)量飲酒可以引起大腦結(jié)構(gòu)和功能的永久性損害[10]，造成認(rèn)知功能紊亂和神經(jīng)退行性疾病，這與本研究的8%、12%的酒精濃度組大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)和穿越原站臺(tái)的次數(shù)顯著減少相一致。不同劑量酒精對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一系列影響，但酒精攝入與認(rèn)知功能障礙之間的劑量-反應(yīng)關(guān)系尚不清楚[11]。有研究證實(shí)，長(zhǎng)期大量飲酒后能顯著抑制體內(nèi)抗氧化酶的活性，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)過(guò)多的氧自由基無(wú)法被清除[12]，這與本研究的8%、12%的酒精濃度組大鼠血清中SOD活性顯著下降和MDA含量顯著增加相一致。

長(zhǎng)期過(guò)量攝入酒精能夠顯著減少腦內(nèi)DA的含量，從而引起大鼠的異動(dòng)行為，進(jìn)一步引起學(xué)習(xí)記憶功能障礙。酒精對(duì)大腦的損傷一定程度上與增強(qiáng)體內(nèi)自由基的毒性及氧化作用相關(guān)，但酒精是否通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)的下游受體和相關(guān)蛋白導(dǎo)致突觸可塑性降低而影響學(xué)習(xí)記憶能力，有待于更深一步研究。