趙婷婷，胡 琳，2，張浩軍，李 平★

（1.中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學研究所；北京市免疫炎性疾病重點實驗室，北京 100029；2.北京化工大學 生物工程專業(yè)，北京 100029）

心肌纖維化是大多數心血管疾病共同病理特征，主要表現為心肌成纖維細胞過度增殖以及細胞外基質過度沉積[1]。心肌纖維化不僅是導致心力衰竭的一個主要原因，而且與心血管死亡風險直接相關[2，3]。糖尿病腎 病（diabetic kidney disease，DKD）伴發(fā)心血管疾病的風險高，患者因心血管疾病導致死亡的可能性是其進入終末期腎病的5～10 倍[4]。因此對DKD 患者的治療應重視減輕其心血管損傷。糖腎方是課題組在繼承名老中醫(yī)經驗基礎上研制的治療DKD 復方中藥，前期多中心臨床試驗和體內動物實驗均顯示其療效確切[5～8]。

本文旨在探討糖腎方治療DKD 大鼠心肌纖維化的作用，并用網絡藥理學方法對糖腎方活性化合物成分及抗纖維化靶點進行系統研究。

1 材料與方法

1.1 動物造模與給藥

Wistar 大鼠20 只，雄性，體重180～220g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK （京） 2007-0001。適應性喂養(yǎng)1 周，行基礎狀態(tài)測定，剔除血糖與尿蛋白異常的動物。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，常規(guī)消毒，背部切口1～1.5cm，暴露右腎，剝離腎臟脂肪及腎上腺，結扎右腎門血管，切除右腎，縫合切口。術后1 周后，按40mg/kg 腹腔注射1%的鏈脲佐菌素，72h后尾尖采血測血糖，＞16.7mmol/L 為造模成功[9]。另取6 只動物作為空白組，戊巴比妥鈉麻醉后進行假手術，消毒切口后暴露右腎，不做其他處理，縫合切口，1 周后腹腔注射檸檬酸緩沖液。

造模成功大鼠12 只，隨機分為模型組和糖腎方治療組（2.67g/kg/d，相當于臨床劑量10 倍），每組6 只?？瞻捉M和模型組大鼠給予同容積的蒸餾水，連續(xù)給藥20 周。糖腎方配方顆粒由江陰天江藥業(yè)有限公司加工，4g/袋，批號060632。

造模后第20 周，戊巴比妥鈉麻醉處死動物，取心肌組織固定于10%中性甲醛溶液，包埋切片后進行Masson’s trichrome 染色。光鏡下觀察心肌組織病理學變化，并采用Image J 軟件統計其膠原面積百分比。

1.2 網絡藥理學研究

1.2.1 主要化合物成分篩選和收集

利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP） 分別檢索出糖腎方七味中藥（大黃、地黃、黃芪、三七、枳殼、山茱萸、鬼箭羽）的化合物成分，采用網絡藥理學中常用的化合物成分篩選方法和條件，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug like，DL）≥0.18 篩選化合物成分作為候選活性成分。

1.2.2 化合物靶點收集

通過中醫(yī)藥百科全書 （the Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）數據庫、證候關聯（Symptom Mapping，SymMap）數據庫、化學相似性系綜法（similarity ensemble approach，SEA）搜索引擎和STITCH 數據庫檢索候選活性成分靶點，將整理收集到的靶點導入Uniprot 數據庫，剔除非人源靶點，并將靶點的基因名稱校正為通用名稱，建立成分-靶點數據集。

1.2.3 化合物-靶點相互作用網絡的構建

使用Cytoscape3.7.2 對查詢到的化合物成分以及其對應的作用靶點進行相關網絡構建。

1.2.4 疾病靶點的獲取

在OMIM 數據庫、 TTD 數據庫、Drugbank 數據庫和Pubmed-gene 數據庫中檢索關鍵詞“myocardial fibrosis”，收集心肌纖維化疾病相關靶點。

1.2.5 藥物-疾病蛋白質互作（protein-protein interaction，PPI）網絡圖及Hub 基因分析

將糖腎方主要化合物成分靶點與心肌纖維化靶點相關靶蛋白上傳至String 數據庫，獲取PPI數據，以置信度為0.7 為篩選條件，確保其數據的可靠性，后建立藥物-疾病PPI 網絡圖。將得到的PPI 數據導入到Cytoscape 3.7.2 進行可視化分析，利用cytoHubba 插件中基于度的方法計算得到網絡拓撲參數，選擇二者共同擁有且degree 數值排名前20 的靶點作為糖腎方映射到心肌纖維化發(fā)病的關鍵靶點。

1.2.6 靶基因功能富集和通路分析

通過DAVID 將PPI 網絡中的節(jié)點蛋白進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes） 通路富集分析，將分析結果在R 軟件中進行圖形可視化，得到糖腎方化合物靶點蛋白的基因功能以及糖腎方治療DKD 心肌纖維化的潛在作用靶點在信號通路中的作用。

2 結果

2.1 糖腎方對DKD 大鼠心肌纖維化的治療作用

通過Masson’s trichrome 染色觀察各組大鼠心肌膠原沉積狀況，發(fā)現DKD 大鼠心肌間質和心肌微血管周圍膠原沉積增多、 纖維化發(fā)生情況顯著（P<0.05），給予糖腎方20 周干預后可顯著降低DKD 大鼠心肌纖維化狀況 （P<0.05，圖1 見封底）。

圖1 糖腎方顯著降低單側腎切除合并鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病大鼠心肌膠原沉積（Masson’s trichrome染色，×200）。A.假手術組；B.糖尿病腎病模型組；C. 糖尿病腎病+糖腎方治療組；D.各組膠原面積百分比半定量分析。

2.2 糖腎方中候選化學成分

通過TCMSP 數據庫的檢索，收集到大黃100個、鬼箭羽120 個、黃芪117 個、三七221 個、 山茱萸299 個、枳殼18 個、地黃86 個化學成分。經OB 和DL 篩選，得到268 個有效活性成分：大黃24 個、鬼箭羽25 個、黃芪41 個、三七51 個、山茱萸100 個、枳殼12 個、地黃15 個。

2.3 糖腎方化合物靶點收集

通過 ETCM、SymMap、SEA搜索引擎和STITCH 數據庫檢索候選活性成分的靶點，268 個化合物活性成分對應7751 個作用靶點：其中大黃對應靶點1105 個，鬼箭羽214 個，黃芪1343 個，三七1527 個，山茱萸1608 個，枳殼1542 個，地黃412 個。在靶點與藥物的相互對應關系中，存在多種中藥共有多個相同的靶點。

2.4 糖腎方-心肌纖維化相互作用網絡的構建

在OMIM、TTD、Drugbank 和Pubmed-gene 數據庫檢索關鍵詞，共收集到601 個心肌纖維化疾病相關靶點。將糖腎方活性成分靶點和心肌纖維化疾病靶點匹配后，得到277 個潛在靶點。

2.5 Hub 基因分析及與活性化合物對應關系

“度值”表示網絡中節(jié)點與節(jié)點相連的數目。度值（degree）排名前20 的關鍵靶點基因網絡連接情況見圖2。將上述靶點依次導入DisGeNET 數據庫，得到其蛋白屬性。大部分基因都參與炎癥反應，如IL6、IL4、TLR4、IL1A、CXCR4 等；VEGFA、KDR 等主要參與血管細胞內皮的增殖分裂、從而促進新生血管的生成；FN1 作為纖維連接蛋白，影響心肌纖維化；此外，還有一些靶點參與了信號傳導、物質運輸和酶活調節(jié)等。

圖2 糖腎方治療心肌纖維化前20 個關鍵靶點相互作用網絡圖

糖腎方七味藥共有49 個化合物參與前20 個靶點蛋白的調控，同時調控3 個以上靶點的化合物有9 個。其中β-谷甾醇（Beta-sitosterol）是大黃、三七、山茱萸、枳殼和鬼箭羽五味藥的共同活性成分；槲皮素（quercetin）是黃芪、鬼箭羽、山茱萸和三七四味藥的共同活性成分，山奈酚（kaempferol）是黃芪和鬼箭羽的共同活性成分；谷甾醇（sitosterol）是地黃、山茱萸、鬼箭羽的共同活性成分。

2.6 GO 富集和KEGG 通路分析

對篩選到的277 個靶點進行GO 富集分析，按顯著性由高到低排序并繪制了氣泡圖。我們發(fā)現糖腎方的關鍵靶點主要富集于2741 個生物過程、72 個細胞組分和167 個分子功能。

在生物學過程 （biological process，BP） 分析中，糖腎方對循環(huán)系統過程、血液循環(huán)、調節(jié)血管系統發(fā)育、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾等影響較大。

分子功能（molecular function，MF）分析顯示（圖3，見封底），糖腎方成分的功能主要與受體配體活性（receptor ligand activity）、細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）、細胞因子活性（cytokine activity）、生長因子活性（growth factor activity）、氨基化合物結合（amide binding）關系密切。

圖3 糖腎方治療心肌纖維化靶點蛋白GO富集分析（分子功能）

在細胞組分（cellular component，CC）分析中，這些靶點主要與細胞外基質、囊腔、胞質囊腔、內質網腔、質膜的外側等相關。

KEGG 通路分析中，共得到136 條具有明顯意義的通路（P<0.05，FDR<0.05），靶點參與的主要通路見圖4 （封底），X 軸表示富集因子、Y 軸為通路名稱，氣泡顏色代表在該條通路上靶基因的富集程度，氣泡大小代表該條通路上所富集基因數量。10 條通路中，與糖腎方治療心肌纖維化相關度最高的通路依次為：細胞因子-細胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、液體剪切應力和動脈粥樣硬化信號 （fluid shear stress and atherosclerosis）、 蛋白多糖在癌癥中的作用（proteoglycans in cancer）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路 （AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）等。

圖4 糖腎方治療心肌纖維化靶點蛋白KEGG通路分析

3 討論

文獻研究[10，11]發(fā)現糖腎方的七味藥中黃芪、山茱萸、三七、枳殼等均在心血管系統疾病中廣泛應用，具有良好保護作用。本文采用單側腎切除合并鏈脲佐菌素腹腔注射誘導的DKD 大鼠，進行糖腎方治療20 周，首次發(fā)現糖腎方具有顯著抑制DKD 心肌纖維化的作用。

網絡藥理學研究發(fā)現，炎癥反應相關基因、促血管生成基因和纖維化標志分子是糖腎方治療心肌纖維化的關鍵靶點。炎癥被認為是心肌纖維化重要誘因，抗炎治療能夠減輕慢性腎臟病患者心血管風險[12]。炎癥能夠誘導釋放IL-1、IL-6，IL-1β，IL-8，TNF-α、TGF-β、CRP、 纖維蛋白原等細胞因子[13]，它們誘導了前纖維化和動脈粥樣硬化的進程。糖腎方治療心肌纖維化相關度最高的通路為細胞因子-細胞因子受體相互作用通路。細胞因子可分為促炎因子和抗炎因子。IL-6 是糖腎方治療心肌纖維化網絡節(jié)點度值最高的靶點，它是一個多效細胞因子，具有促炎作用。有研究證實，心臟成纖維細胞過度合成IL-6，會促使纖維化因子表達，加速心肌纖維化[14]，而IL-6 抑制劑能夠有效減輕模型小鼠的心肌纖維化程度[15]。課題組前期發(fā)現糖腎方能夠顯著抑制DKD 大鼠腎臟和循環(huán)系統IL-6 等炎癥因子的表達[6]，提示抑制炎癥反應可能是糖腎方有效治療糖尿病腎臟和心臟損傷的共同機制。

糖腎方七味藥有效成分眾多，其中槲皮素、黃芩素、山奈酚、人參皂苷rh2、柚皮素、油酸、亞油酸、蘆薈大黃素等化合物作用靶點最多，是糖腎方治療心肌纖維化的主要活性成分。槲皮素和黃芩素均能夠抑制AngII 誘導的心肌成纖維細胞膠原I 和膠原III 的分泌[16，17]，該作用在AngII 心肌纖維化小鼠和異丙腎上腺素心肌纖維化大鼠模型上得到驗證[18，19]。槲皮素、黃芩素、山奈酚和柚皮素4 種化合物均是黃酮類化合物，提示黃酮類化合物可能是糖腎方治療心肌纖維化的有效部位。