周 鑫，繆曉磊，余學(xué)軍

（浙江農(nóng)林大學(xué)/省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311300）

0 引言

雷竹(Phyllostachysviolascens)是浙江省筍用竹子主載品種，種植面積占浙江總竹林面積的10%左右，已發(fā)展了稻草、礱糠、麥麩等多種覆蓋集約種植模式[1-2]，為浙江省蔬菜市場(chǎng)提供了價(jià)格實(shí)惠、質(zhì)量?jī)?yōu)良的食用筍來源[3]。然而隨著雷竹種植集約化規(guī)模的無(wú)序擴(kuò)大、覆蓋度的增加，超出種植容量，土壤酚酸類化合物增加，導(dǎo)致土壤酸化，土壤退化日益嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，富陽(yáng)、臨安等地部分雷竹林土壤已到達(dá)pH 4.0，全年覆蓋竹林地土壤總酚酸含量約高于無(wú)覆蓋竹林地1.2～3.0倍，已嚴(yán)重制約雷竹產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展[4]。毛栓菌是較有效降解木質(zhì)素的微生物之一，能在純系培養(yǎng)中通過分泌漆酶將木質(zhì)素降解成CO2和H2O[5]。漆酶在木質(zhì)素分解過程中起著重要作用，以O(shè)2為電子受體催化多酚化合物，經(jīng)單電子傳遞形成酮及自由基的含銅蛋白酶[6]，廣泛的底物特異性使其對(duì)土壤中多環(huán)芳烴(PAHs)[7]、多氯聯(lián)苯[8]、苯胺類廢水[9]等難降解污染物也具有催化降解作用。因此，極其有必要研究漆酶對(duì)酚酸類化合物的降解特性，以便更好地應(yīng)用于雷竹林經(jīng)營(yíng)，促進(jìn)竹產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。目前對(duì)漆酶的研究主要集中在高產(chǎn)菌株的篩選和發(fā)酵優(yōu)化及漆酶對(duì)木質(zhì)素的生物降解等方面[10-12]。漆酶在木質(zhì)素降解[12]、有機(jī)染料的降解[13]、有機(jī)污染物的轉(zhuǎn)化[8]等方面已有應(yīng)用研究，也有用于連作土壤修復(fù)[14]的研究報(bào)道。筆者團(tuán)隊(duì)前期篩選獲得了1株優(yōu)良的毛栓菌菌株Trametes hirsuta27-1，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)漆酶能力較強(qiáng)且產(chǎn)生的漆酶具有較高的穩(wěn)定性[15]。為深入了解該菌株發(fā)酵產(chǎn)漆酶對(duì)酚酸類化合物的降解效能，以丁香酸為酚酸類化合物的代表，采用液相色譜分析法，篩選丁香酸降解最佳條件的漆酶活性。優(yōu)化漆酶活性的條件，提高漆酶對(duì)酚酸類化合物丁香酸降解效能，從而為雷竹林土壤酚酸類化合物降解的綜合應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)采用的毛栓菌27-1屬于真菌，是由李新鑫等篩選鑒定的白腐真菌，該菌株通過真菌的ITS序列測(cè)定和比對(duì)，確定為擔(dān)子菌綱多孔菌科栓菌屬的毛栓菌(Trameteshirsuta)[15]。該菌株漆酶活性可達(dá)94.39 U，在4℃保存，30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。酚酸類化合物包括阿魏酸、香草酸、丁香酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、龍膽酸、原兒茶酸、芥子酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)使用的超高效液相色譜儀UPLC(1260 Infinity II Prime LC)、色譜柱 Agilengt EC-C18(2.7 μm，3.0 mm×150mm，100 MPa)由美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn)。

實(shí)驗(yàn)于2019年10月—2020年9月在浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 酶液制備

在裝液量為150 mL的250 mL三角瓶中接種12.5%的種子液，在30℃的條件下，以200 r/min的轉(zhuǎn)速發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基接種培養(yǎng)7天后取適量的發(fā)酵液，在4℃下以8000 r/min離心10 min，取上清液為粗酶液，4℃保存。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯250 g，葡萄糖20 g，蛋白胨15 g，蒸餾水1 L，自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酒石酸銨0.2 g/L，NH4NO30.1 g/L，麩皮8 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，CaCl21 g/L，微量元素液60 mL，醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)0.01 mol/L。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 分別稱取適量阿魏酸、丁香酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、綠原酸、龍膽酸、原兒茶酸、芥子酸、對(duì)香豆酸和咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品，用80%甲醇溶解，配制成濃度均為500mg/L的母液，再用超純水稀釋，配制濃度分別為 0.01、0.1、10、20、40、100、200、500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 超高效液相色譜分析

（1）色譜條件。柱溫左25℃、右25℃，進(jìn)樣量2μL，流動(dòng)相0.5%乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～15min 2%～25%B；15～20 min 25%～40%B)，流速 0.6 mL/min，DAD紫外檢測(cè)波長(zhǎng)274 nm和320 nm。酚酸類化合物的檢測(cè)波長(zhǎng)及保留時(shí)間分別為香草酸274 nm、8.145 min；丁香酸274 nm、8.902 min；對(duì)羥基苯甲酸274 nm、6.735 min；原兒茶酸274 nm、4.744min；綠原酸320nm、7.533min；龍膽酸320nm、6.179min；芥子酸320 nm、12.235 min；對(duì)香豆酸320 nm、10.793 min；咖啡酸320nm、8.440min；阿魏酸320nm、12.025min。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

圖1 10種酚酸標(biāo)準(zhǔn)樣品和供式菌液處理樣品色譜圖

（2）線性考察。對(duì)1.3.1節(jié)配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.3.2節(jié)的色譜方法進(jìn)行分析，以峰面積Y為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量X為縱坐標(biāo)，計(jì)算10種酚酸線性回歸方程（表1）。在線性范圍內(nèi)，此方法進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

（3）精密度實(shí)驗(yàn)。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)樣2μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，在1.3.2（1）色譜條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積。10種酚酸面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)都小于0.5%，表明儀器的精密度良好。

（4）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在室溫環(huán)境下分別放置0、2、4、8、12、18、24 h，在1.3.2色譜條件下，記錄峰面積，原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、芥子酸峰面積的RSD分別為0.589%、0.658%、0.652%、0.851%、1.025%、0.685%、1.245%、0.689%、0.785%、1.065%，說明本實(shí)驗(yàn)樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，可進(jìn)行多次檢測(cè)。

（5）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。取同一標(biāo)準(zhǔn)樣品的5份，按1.3.2（1）色譜條件測(cè)定峰面積。測(cè)得10種酚酸的峰面積RSD＜5%，重復(fù)性良好。

（6）加樣回收率實(shí)驗(yàn)。精密取同一已知酚酸含量的發(fā)酵菌酶液樣品3份，每份5.0 mL，分別加入0.5、1、1.5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3.2（1）色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、芥子酸的平均加樣回收率分別為98.36%、104.24%、98.27%、102.79%、105.43%、101.56%、103.62%、97.24%、99.12%、102.35%，本方法準(zhǔn)確度可靠。

1.3.3 漆酶降解酚酸類物質(zhì)的效能檢測(cè) 取粗酶液10 mL和定量的酚酸（濃度為10 mg/L）于50 mL錐形瓶放入30℃、200r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)降解，24 h內(nèi)每隔2 h取樣測(cè)定降解液中酚酸殘留率[式(1)]。

式中，ct為t時(shí)刻酚酸濃度(mg/L)，c0為初始酚酸濃度(mg/L)。采用1.3.2（1）的超高效液相色譜條件分析，檢測(cè)降解體系中的酚酸類化合物的變化，在UPLC測(cè)定各組分含量前，樣品需要過0.45 μm微孔濾膜注入進(jìn)樣瓶。

1.3.4 不同降解條件下漆酶降解丁香酸的效能檢測(cè) 采用0.10 mg/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)降解液的初始pH，分別在降解液初始為pH 3、4、5、6、7的條件下，于30℃下探究不同初始pH對(duì)毛栓菌27-1漆酶降解特性的影響；在初始pH 5的條件下，設(shè)置溫度分別為10、20、30、40、50℃，探究不同溫度對(duì)毛栓菌27-1漆酶降解特性的影響；在初始pH 5、培養(yǎng)溫度30℃的條件下，將降解液中丁香酸濃度設(shè)置為0.1、1、10、100、500 mg/L，探究不同初始酚酸濃度對(duì)毛栓菌27-1漆酶降解特性的影響。

催化介體可有效提高漆酶降解能力，采用不同濃度的ABTS溶液作為介體物質(zhì)，在30℃、初始pH 5、香草酸濃度10mg/L的條件，設(shè)置ABTS溶液的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L，探究不同濃度介體ABTS溶液對(duì)毛栓菌27-1漆酶降解效能的影響。

式中，c1為殘留酚酸濃度(mg/L)，c0為初始酚酸濃度(mg/L)。設(shè)置對(duì)照組，以滅活的酶液和同體積的超純水重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 漆酶活性測(cè)定 采用以2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)為反應(yīng)底物的方法測(cè)定，室溫為25℃，反應(yīng)體系3 mL，反應(yīng)底物為2 mL的溶解于0.1 mmol/L的醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)緩沖液中的濃度為0.5 mmol/L的ABTS，加入1 mL的酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，測(cè)定最初3 min內(nèi)420 nm處的吸光值變化。定義每分鐘氧化1 μmol的ABTS為一個(gè)酶活單位[ε=3.6×104L/(mol·cm)][16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛栓菌27-1漆酶降解酚酸類物質(zhì)的效能檢測(cè)

在30℃、pH 5條件下漆酶對(duì)10種酚酸類化合物的降解效能如圖2所示。毛栓菌27-1漆酶可有效降解香草酸、咖啡酸和芥子酸，3種酚酸在8 h內(nèi)能被完全降解，開始的降解速率較低，2 h后對(duì)3種酚酸降解速率顯著提升，6 h時(shí)咖啡酸殘留率不到10%。說明毛栓菌27-1漆酶對(duì)香草酸、咖啡酸和芥子酸有良好的降解效果。

圖2 毛栓菌27-1漆酶對(duì)不同酚酸底物的降解效能

毛栓菌27-1漆酶對(duì)丁香酸、阿魏酸和龍膽酸降解轉(zhuǎn)化效率一般，通過12 h處理后，前兩者殘留率分別還有47.41%和49.67%，降解轉(zhuǎn)化了近一半，而龍膽酸的降解效果較差，殘留率還有68.21%。在24 h后（圖2中未標(biāo)注出24 h殘留率），丁香酸、阿魏酸和龍膽酸的殘留率分別為47.32%、48.98%、65.56%，與12 h的殘留率差異不顯著。

原兒茶酸、對(duì)香豆酸、對(duì)羥基苯甲酸和綠原酸在12 h和24 h的殘留率分別為87.30%、96.23%、93.31%、99.84%和86.40%、96.23%、92.76%、99.65%，表現(xiàn)出除原兒茶酸外，毛栓菌27-1漆酶對(duì)其他3種酚酸幾乎沒有降解效果。說明毛栓菌27-1漆酶產(chǎn)生的漆酶對(duì)酚酸種類降解效能具有差異性。

2.2 不同降解條件下漆酶降解丁香酸的效能檢測(cè)

根據(jù)2.1節(jié)毛栓菌27-1漆酶對(duì)10種酚酸類化合物的降解情況，以降解率居中(50%)的丁香酸為代表，進(jìn)一步分析毛栓菌27-1漆酶對(duì)丁香酸降解的最優(yōu)組合條件。丁香酸對(duì)生態(tài)環(huán)境有一定危害，有報(bào)道丁香酸對(duì)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有印制作用[17]。因此，更有必要深入探究漆酶在溫度、pH、初始濃度和介體ABTS溶液等外界不同條件對(duì)其的降解效能。

在30℃、自然pH條件下，對(duì)比滅活粗酶液、粗酶液和超純水對(duì)丁香酸的降解效能（表2），可分析出漆酶是主要降解因素。

表2 不同液體對(duì)丁香酸降解效能（殘留率） %

2.2.1 不同溫度對(duì)漆酶降解效能的影響 從圖3可以看出，在20、30、40℃條件下均有降解效果，在降解24 h后的殘留率分別為70.69%、44.63%和56.48%。而在50℃時(shí)，毛栓菌27-1漆酶幾乎對(duì)丁香酸沒有降解效果。在低溫，如10℃時(shí)24 h后丁香酸殘留率87.25%，雖有一定降解效果，但效果較差。參照漆酶酶活的變化，24 h后酶活隨著溫度的升高而降低，推測(cè)低溫雖然維持了毛栓菌27-1漆酶的活性，但不利于降解，高溫會(huì)顯著降低漆酶活性，抑制降解。在30℃時(shí)毛栓菌27-1漆酶表現(xiàn)出最優(yōu)降解效果。毛栓菌27-1漆酶降解丁香酸的效能與溫度的關(guān)系呈倒U曲線。

圖3 不同溫度對(duì)毛栓菌27-1漆酶降解效能的影響

2.2.2 不同初始pH對(duì)漆酶降解效能的影響 從圖4可知，在中性和酸性下，菌株對(duì)丁香酸都有一定的降解效果。在初始pH 5時(shí)，12 h和24 h后殘留率分別為47.41%、47.32%，無(wú)顯著差異，表現(xiàn)出最好降解效果。在初始pH 3、4、6、7時(shí)，降解24 h后的殘留率分別為65.56%、50.64%、75.46%、70.85%，在4 h開始表現(xiàn)出降解效果后，到24 h殘留率都為持續(xù)下降，而pH 5時(shí)在12 h就達(dá)到最低殘留率。在初始pH 3、4、5、6、7時(shí)，24 h后漆酶活性依次為78.18、81.65、80.55、77.25、75.54 U，可見初始pH對(duì)漆酶活性降低影響不大。所以該菌株在pH 5時(shí)，降解效果達(dá)到最佳。

圖4 不同初始pH對(duì)毛栓菌27-1漆酶降解效能的影響

2.2.3 不同初始濃度丁香酸對(duì)漆酶降解效能的影響 從圖5可知，在丁香酸初始濃度過低(0.1 mg/L)的降解條件下，未觀察到明顯的降解現(xiàn)象。在1、10、100 mg/L的丁香酸濃度條件下，毛栓菌27-1漆酶對(duì)丁香酸具有良好的降解效果，24 h后的殘留率分別為43.35%、43.84%、45.54%。在1mg/L的初始濃度時(shí)，8 h后的殘留率為50.64%，已有較好降解效果。而在高濃度(500 mg/L)的降解條件下，丁香酸雖然減少，但不顯著，24 h后殘留率仍有90.44%。在低濃度時(shí)，24 h后漆酶活性降低程度差異不大，在500 mg/L濃度時(shí)顯著降低，表明高濃度酚酸會(huì)降低毛栓菌27-1漆酶的活性。所以毛栓菌27-1漆酶對(duì)較低濃度丁香酸降解效果不明顯，而高濃度丁香酸對(duì)毛栓菌27-1漆酶的降解能力有抑制作用。

圖5 不同初始濃度丁香酸對(duì)毛栓菌27-1漆酶降解效能的影響

2.2.4 不同濃度介體ABTS溶液對(duì)漆酶降解效能的影響 如圖6所示，毛栓菌27-1漆酶對(duì)丁香酸的降解率隨著ABTS溶液濃度增大而提高，在不使用ABTS溶液作為介體時(shí)，降解率只有52.68%，而在0.5 mmol/L濃度時(shí)，降解率達(dá)到100%。在無(wú)ABTS溶液時(shí)的降解率與其他各濃度條件下的降解率都存在顯著差異性。表明加入ABTS介體物質(zhì)后丁香酸的降解效果顯著提升。

圖6 不同濃度介體ABTS溶液對(duì)毛栓菌27-1降解效能的影響

3 結(jié)論與討論

真菌漆酶的催化底物較為廣泛，主要包括酚類和芳香類化合物[18]。酚酸類化合物指在一個(gè)苯環(huán)上有多個(gè)酚羥基取代的芳香羧酸類化合物[19]，由不同酚羥基取代形成不同種類。在酚酸類底物中，漆酶對(duì)于底物的降解主要產(chǎn)生自由基，產(chǎn)物不穩(wěn)定，可進(jìn)行二次酶催化氧化和非酶促反應(yīng)，如水合、歧化和聚合[20]，進(jìn)而降解去除。本實(shí)驗(yàn)所探究的毛栓菌27-1產(chǎn)生的漆酶對(duì)酚酸類化合物降解表現(xiàn)出差異性，其能完全降解香草酸、咖啡酸和芥子酸，不能降解香豆酸、對(duì)羥基苯甲酸和綠原酸，對(duì)其他幾種酚酸類化合物降解效果不同，這可能與酚酸類物質(zhì)苯環(huán)母核上的取代基不同相關(guān)，例如羧基、羥基和甲氧基等取代基類型及位置，也與毛栓菌27-1的漆酶本身特異性相關(guān)。

理化性質(zhì)是影響漆酶對(duì)酚酸降解的重要因素[21]，主要包括溫度、pH等。一般真菌漆酶的最適反應(yīng)溫度在25～50℃之間，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果最適溫度為30℃，雖然低溫條件可較好維持粗酶液中漆酶酶活，但不利于降解反應(yīng)，說明反應(yīng)效果不僅由酶活高低決定。現(xiàn)在也有較耐高溫真菌漆酶的報(bào)道，Marasmiusquercophilus漆酶[22]在75℃條件下半衰期為10 min；pH也是影響酶活性的關(guān)鍵因素之一，雖然多數(shù)真菌漆酶的最適反應(yīng)在pH 4.0～6.0，但不同漆酶間最適pH可能不同，同一種漆酶的作用底物也有所不同，所以其最適pH存在差異。理化性質(zhì)會(huì)影響毛栓菌產(chǎn)漆酶的能力，本實(shí)驗(yàn)探究降解效能運(yùn)用的是粗酶液，為避免菌體的影響，后續(xù)可深入探究用菌體直接培養(yǎng)降解酚酸。

小分子介體存在常常對(duì)漆酶跟酚酸類化合物的聚合作用有抑制，而此時(shí)漆酶對(duì)這類化合物的降解作用則起主要作用[8]，介體可以起橋梁的作用，首先由漆酶氧化后再進(jìn)行介體引導(dǎo)底物的氧化。常見的介體有ABTS（2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、HBT(1-hydroxybenzotriazole)、NHA(N-hydroxyacetanilide)、3-hydroxyanthranilicacid 和 VIO(violuricacid)等[23-25]。漆酶介體體系(LMS)目前有較多研究報(bào)道，在生物燃料、綠色有機(jī)物合成、食品工業(yè)、生物傳感器、生物檢測(cè)等領(lǐng)域都有應(yīng)用[26]。伴隨著介質(zhì)體系的深入研究，漆酶能催化底物的范圍將進(jìn)一步擴(kuò)大，漆酶的應(yīng)用領(lǐng)域及其價(jià)值也將得到進(jìn)一步的發(fā)展和提高。本實(shí)驗(yàn)中利用ABTS溶液作為介體物質(zhì)，可大大提高毛栓菌27-1漆酶對(duì)酚酸的降解能力。