王若焱，華 萃，檀龍顏，王道平，張 忠，吳月君

（1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 550025；2遵義金喜農(nóng)業(yè)科技有限公司，貴州遵義 563000；3貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，貴陽 550000）

0 引言

太子參是常用中藥材，為石竹科植物孩兒參(Pseudostellariaheterophylla)的干燥塊根，具有益氣生津、健脾潤肺的功效[1]。太子參主產(chǎn)于福建、江蘇、貴州、安徽、浙江等省，在中國有近百年的栽培歷史[2-3]。貴州省作為四大藥材產(chǎn)區(qū)之一，引進(jìn)栽培太子參已有20余年[4]，其中施秉縣因種植面積大、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)而擠身于全國太子參藥材市場的生產(chǎn)大縣[5]。然而長期以來，太子參均以塊根進(jìn)行繁殖，使太子參種源易退化，感病率增加，最終導(dǎo)致產(chǎn)量以及品質(zhì)的下降[6-8]。其中病毒病在太子參病害尤為常見[9]，馬鈴薯Y病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、蕪菁花葉病毒等為目前已有病毒種類，發(fā)病率高達(dá)80%～90%[10-11]。田間調(diào)查表明貴州施秉種植區(qū)太子參病毒病一般5月初達(dá)到病害高發(fā)期，已成為制約施秉縣太子參生產(chǎn)進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸之一[12-13]。

然而太子參病毒病的防治缺乏登記用藥，盲目用藥現(xiàn)象時有發(fā)生，對太子參生產(chǎn)安全和質(zhì)量安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅?；瘜W(xué)方法對于太子參病毒病防效有一定的效果，但僅起到一定的預(yù)防作用或在發(fā)病初期得到控制，病毒病發(fā)生后防治效果甚微[14-15]。國內(nèi)藥用植物資源廣泛，能夠產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過20萬種，是生物活性化合物的天然寶庫，其中包含了大量的能控制病毒病的有效成分，既環(huán)保又無毒副作用[16]。前人研究表明從植物中提取的活性物質(zhì)如多糖類、蛋白類等本身雖然對病原菌沒有明顯抑制作用，但可以增強(qiáng)栽培作物的免疫能力，從而達(dá)到抗菌抗病毒的作用[17]。中藥復(fù)方是指由兩味或兩味以上藥用植物組成，通過特定的加工方法，針對相對確定的病癥而設(shè)的方劑，是中醫(yī)方劑的主體組成部分。結(jié)合中醫(yī)“整體觀”、“未病先防”、“整體辯證施治”的理論，將中藥復(fù)方的觀點(diǎn)運(yùn)用于植物，增強(qiáng)目標(biāo)植物自身免疫能力，從而能夠很好地抵抗病毒侵染。課題組前期以金銀花、青蒿為主要原料的中藥復(fù)方抑菌劑發(fā)現(xiàn)對煙草青枯病、白粉病、炭疽病、黑脛病、根黑腐病的病原菌具有體外直接抑菌效果，而大田試驗表明抑菌劑能有效預(yù)防烤煙土傳病害發(fā)生，降低病毒病危害程度，產(chǎn)值比對照提高近30%。但目前中藥復(fù)方應(yīng)用于太子參病毒病的防治研究較少，研發(fā)有效的配方是系統(tǒng)性緩解太子參病毒病的新途徑，在作物領(lǐng)域跨界運(yùn)用中藥復(fù)方解決太子參生態(tài)系統(tǒng)瓶頸問題具有廣闊前景。

因此，本研究為探索太子參病毒病防治的理想藥劑，降低危害損失，確保太子參優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，以可提高作物抗逆性及產(chǎn)質(zhì)量的中藥復(fù)方抑菌水提物為切入點(diǎn)，并根據(jù)文獻(xiàn)記載有抗病活性的藥材為組方，通過太子參大田種植條件下小區(qū)試驗，考察在病毒病自然發(fā)病情況下，各抑菌復(fù)配劑處理對太子參病毒病的防效，同時觀察各處理對太子參產(chǎn)量、太子參總多糖及環(huán)肽B等指標(biāo)的影響，篩選出防治病毒病的最優(yōu)配方，以期獲得一藥多效、高效安全的太子參病毒病防治技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 抑菌劑制備及主要化學(xué)成分

復(fù)配劑總液（試驗中抑菌劑1號，下同）藥材以金銀花、青蒿為主要原料。各原料由貴州省遵義市藥材市場購得。購買后由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室進(jìn)行藥材外觀性狀鑒定。本實(shí)驗將復(fù)配劑制成浸膏，采用試管法和薄層法對復(fù)配劑水煎劑浸膏化學(xué)成分進(jìn)行定性鑒別，明確復(fù)配劑中含有的大類成分和部分單體成分。

1.2 田間試驗時間、地點(diǎn)及農(nóng)事操作

試驗?zāi)攴轂?018年，試驗地為施秉縣優(yōu)匹克生態(tài)發(fā)展有限公司太子參基地（27°08′24.49″N，107°55′33.43″E，海拔937.01 m），選擇太子參連作2年地塊進(jìn)行。各處理統(tǒng)一采用本草中藥復(fù)方土壤改良有機(jī)肥1200 kg/hm2（2017年在茶葉和草莓等作物上經(jīng)過小區(qū)試驗篩選出的最優(yōu)施肥組合，由中藥復(fù)方原粉與米糠炒制而成）。

1.3 抑菌劑配方篩選試驗設(shè)計

設(shè)置5個處理3個重復(fù)小區(qū)試驗，分為以青蒿為主藥進(jìn)行組方加減的形成抑菌劑1號、2號、3號，以及抑菌劑+驅(qū)蟲劑+抗病毒劑形成的混合液。設(shè)置噻菌銅（防治細(xì)菌性病害）、烯酰嗎啉（防治真菌性病害）聯(lián)用為化學(xué)藥劑對照（表1）。本試驗處理替代常規(guī)藥劑，全生育期施用6次，其余生產(chǎn)措施同常規(guī)生產(chǎn)。

表1 中藥復(fù)方抑菌劑配方篩選田間試驗設(shè)計

1.4 復(fù)方病毒防治制劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用試驗設(shè)計

設(shè)置4個處理3個重復(fù)小區(qū)試驗，將從1.3試驗篩選出的最優(yōu)抑菌劑抗病復(fù)方水劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用，對病毒性病害進(jìn)行聯(lián)合防治，觀察不同聯(lián)用處理對太子參病毒病發(fā)生的統(tǒng)防效果。以噻菌銅（防治細(xì)菌性病害）+烯酰嗎啉（防治真菌性病害）+嗎啉胍乙酸銅+氨基寡糖素作為化學(xué)藥劑對照。本試驗處理替代常規(guī)藥劑，全生育期施用6次，其余生產(chǎn)措施同常規(guī)生產(chǎn)（表2）。

表2 中藥復(fù)方病害防治制劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用效應(yīng)田間試驗設(shè)計

1.5 病害調(diào)查及分析方法

1.5.1 病害調(diào)查方法 在太子參生育期，于5月初開始病害發(fā)生高峰期調(diào)查病毒病及葉斑病發(fā)病率。病害調(diào)查時，每小區(qū)隨機(jī)取40株太子參，調(diào)查每個處理小區(qū)的病葉數(shù)，計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果，如式(1)～(3)。病毒病分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無病新芽葉片；1級，病毒病新芽葉片卷曲程度和斑斕狀占全葉的5%以下；3級，病毒病新芽葉片卷曲程度和斑斕狀占全葉的6%～25%；5級，病毒病新芽葉片卷曲程度和斑斕狀占全葉的26%～50%；7級，病毒病新芽葉片卷曲程度和斑斕狀占全葉的51%以上。葉斑病分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無病斑；1級，病斑占全葉5%以下；3級，病斑占全葉6%～25%；5級，病斑占全葉26%～50%；7級，病斑占全葉51%以上。

1.5.2 統(tǒng)計分析方法 統(tǒng)計分析采用Excel；方差分析采用SPSS(version 22.0，SPSS Institute,Inc.)。

1.6 農(nóng)事操作

1.6.1 施用方法 所有處理在太子參大田生長期間采用淋根及葉面噴霧的方式施用3次和5次。先噴霧葉面至有可見水霧附著葉面后，去掉噴頭，將噴管對準(zhǔn)植株頂部，淋根6～8 s，使藥劑順植株流入根系土壤。小苗時可直接用噴霧器將葉面與根部同時噴淋。

1.6.2 施用劑量 化學(xué)藥劑根據(jù)商品說明推薦劑量溶解在15 L（1個標(biāo)準(zhǔn)手動噴霧器容量）清水中。移栽后大田15天后進(jìn)行第一次噴施。每畝太子參施用1壺標(biāo)準(zhǔn)溶劑（標(biāo)準(zhǔn)手動15 L噴霧器）。移栽后30天及50天施用第二次及第三次。每隔7天噴施1次，采收前30天停止噴藥，太子參全生育期約噴施6次。

1.7 檢測方法

方法參考文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌復(fù)配劑總液進(jìn)行主要化學(xué)成分檢驗

復(fù)配劑總黃酮的平均含量為255.3 mg/g(n=6)，總生物堿的平均含量為17.5 mg/g(n=6)，總木質(zhì)素的平均含量為177.0 mg/g(n=6)，總有機(jī)酸的平均含量為211.2 mg/g(n=6)（表3）。由表3可知，復(fù)配劑不同極性部位中總黃酮含量＞總木質(zhì)素含量＞總生物堿含量；正丁醇層和水層中總黃酮的含量最高分別為24.5、21.0 mg/g，水層中木質(zhì)素含量最高為10.4 mg/g，正丁醇層中生物堿含量最高為3.4 mg/g。

表3 1號復(fù)方抑菌劑不同極性部位定量測定結(jié)果 mg/g

2.2 不同抑菌劑配方篩選田間試驗

因在病害調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和真菌性病害發(fā)生率小于2%，故只觀察和分析病毒病指標(biāo)。

2.2.1 對病毒病防效的影響 2018年5月10日對大田各試驗進(jìn)行病害調(diào)查，大田太子參發(fā)生病毒病，未見其他病害。5月11日采用表1～2中處理對連作地太子參進(jìn)行定期預(yù)防，全生育期共計施用6次。截至6月中旬施用3次后5天調(diào)查，抑菌劑1號處理太子參病毒病發(fā)生率比對照降低82.2%(P＜0.01)，病指比對照降低14.7倍，抑菌劑1號防效最高(93.0%，P＜0.01)，其防效比抑菌劑2號提高20.7%；防效第二名的處理為抑菌劑3號處理，防效為91.8%(P＜0.01)。說明抑菌劑1號及3號施用3次后，對太子參病毒病也具有較好防控作用，其余2個抑菌劑配方對病毒病防效均超過70%（表4）。

表4 2018年不同太子參病害防治復(fù)方水劑對病毒病防效比較

2.2.2 對產(chǎn)量的影響 抑菌劑3號及1號對產(chǎn)量提升作用顯著，產(chǎn)量分別比對照提高了69.57%及41.3%(P＜0.05)。抑菌劑4號對產(chǎn)量也有提升作用（提高13.4%，P＜0.05）。抑菌劑2號對太子參產(chǎn)量提升作用不明顯（表5）。

表5 不同抑菌劑配方處理對太子參產(chǎn)量的影響

2.2.3 對品質(zhì)的影響 由表6可知，抑菌劑1號、3號及4號對太子參總多糖及環(huán)肽B含量具有較好提升作用。其中抑菌劑1號對總多糖提升效果最好（提高51.00%）；抑菌劑3號對環(huán)肽B含量提高效果最好（提高52.00%）。

表6 不同抑菌劑配方處理對太子參總多糖及環(huán)肽B含量的影響 %

2.3 中藥復(fù)方病害防治制劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用效應(yīng)試驗

2.3.1 對病毒病的防效 調(diào)查時間及方法同上。由表7可見，由以上試驗優(yōu)選出的各處理在治療太子參病毒病上具有極為顯著防效，除了化學(xué)藥劑單用以外，其他處理對病毒病防效均超過95.00%，其中防效最好的是1號抑菌劑+1號抗病毒劑(99.40%，P＜0.01)，以及與化學(xué)藥劑聯(lián)用99.50%(P＜0.01)。且抑菌劑與其他藥劑組合的處理（1號抑菌劑+化學(xué)藥劑及1號抑菌劑單用）對病毒病均具有較好防效（98.20%及96.50%，P＜0.01）。但各處理發(fā)病率、病情指數(shù)及防效未達(dá)到顯著性差異。

表7 復(fù)方病害防治制劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用效應(yīng)試驗處理對病毒病防效的影響

2.3.2 對產(chǎn)量的影響 與病毒病防效效果相同，1號抑菌劑+1號抗病毒劑及與化學(xué)藥劑聯(lián)用2個處理產(chǎn)量均比對照提高了1倍，對產(chǎn)量提升作用顯著(P＜0.05)。1號抑菌劑+化學(xué)藥劑與1號抑菌劑單用均對產(chǎn)量也有顯著提升作用（提高65%，P＜0.05）（表8）。

表8 復(fù)方病害防治制劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用處理對產(chǎn)量的影響

2.3.3 對品質(zhì)的影響 在有機(jī)級別病害防治制劑中，1號抑菌劑+1號抗病毒劑對太子參總多糖含量提高效果最好，提高了15%；對提高環(huán)肽B含量效果最好，提高了12%。其中1號抑菌劑單用對總多糖含量也有提升效果，提高了4%，環(huán)肽B含量提高了12%。在綠色級別病害防治組合中，1號抑菌劑+1號抗病毒劑+化學(xué)藥劑對品質(zhì)也有提升作用，分別提高總多糖含量5%及8%。單用化學(xué)藥劑對品質(zhì)有影響，總糖降低6%（表9）。

表9 復(fù)方病害防治制劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用處理對品質(zhì)的影響 %

3 討論

3.1 中藥復(fù)方主要成分

中藥復(fù)方中成分的鑒定分析是中藥現(xiàn)代化研究的重要組成部分之一，對闡明中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制、開發(fā)現(xiàn)代中藥新藥等具有重要意義[3]。藥用植物復(fù)方作用機(jī)理研究上和化學(xué)藥劑存在著顯著的區(qū)別?；瘜W(xué)藥劑一般可明確其有效成分至單一化合物，但藥用植物活性物質(zhì)水煎液中化學(xué)成分大多以絡(luò)合態(tài)存在，種類較多，難以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定性定量分析，其有效成分單一化合物無法解釋其總液表現(xiàn)出的功效，得到的一般為陰性結(jié)果。藥用活性物質(zhì)化學(xué)物質(zhì)之間可能存在協(xié)同效應(yīng)，不同活性部分對應(yīng)一個或多種功能，傳統(tǒng)化學(xué)藥劑分析方法顯然難以適應(yīng)藥用植物的生理生化特性，滿足藥用植物活性鑒定的需要。

在以往的研究中[18]，在藥用活性植物復(fù)配劑活性鑒定（即有效部位鑒定）中采用缺一味的方法（采用正交旋轉(zhuǎn)法設(shè)計實(shí)驗方案）進(jìn)行活性檢測，由于其工作量大，可操作性低。后期筆者對復(fù)配劑總液進(jìn)行主要化學(xué)成分檢驗。同時將總液用正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、水層提取方法進(jìn)行提取形成水煎液后，分析不同極性部位水煎液中主要化學(xué)成分，為最終鑒定有效極性部位提供必要的化學(xué)分析基礎(chǔ)[19-20]。筆者可在本文研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將優(yōu)選出的復(fù)配物分4個部位提取浸膏，觀察各部位對病害防治靶標(biāo)的活性，進(jìn)一步系統(tǒng)研究其可能的防控機(jī)制。

3.2 中藥復(fù)方復(fù)配物防控太子參病害可能的機(jī)制

貴州太子參連作障礙現(xiàn)象較為嚴(yán)重，所以田間病毒病也較為普遍[21-23]。有研究報道，在太子參病毒病發(fā)病初期可用化學(xué)藥劑控制[14-15]，說明化學(xué)藥劑的防效有限[24]。筆者先前采用中藥復(fù)方抗病毒劑對太子參病毒病進(jìn)行防治取得了較好的效果[12]。本文采用抑菌劑對真菌、細(xì)菌和病毒等病害進(jìn)行防治，結(jié)果發(fā)現(xiàn)真菌和細(xì)菌病害發(fā)生率極低，但抑菌劑對病毒病的防治也具有較好的效果，盡管與中藥復(fù)方抗病毒劑相比效果略低。這可能與該抑菌劑中測得的總黃酮、生物堿、總木質(zhì)素、總有機(jī)酸含量較高有關(guān)[25-28]。病毒必須依賴宿主才能生存，阻斷病毒在宿主體內(nèi)任一復(fù)制環(huán)節(jié)均能達(dá)到抗病毒的目的[29]。中藥黃酮以及有機(jī)酸具有直接殺滅病毒、抑制病毒顆粒侵入細(xì)胞、抑制病毒核酸在宿主細(xì)胞的復(fù)制和合成、調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)等作用[30]。雖目前未有關(guān)于植物病毒方面的防治報道，但能夠抵抗動物體內(nèi)流感、乙肝、柯薩奇等病毒，并且效果顯著[31-33]。而生物堿以及木質(zhì)素在植物類病毒防治方面取得較為理想的效果[34]。如蹇軍友等[26]通過活性追蹤烏頭生物總堿對煙草花葉病毒的抗性，大量篩選后發(fā)現(xiàn)其對煙草花葉病毒侵染抑制率為23.5%。楊輝等[26]對不同抗性的辣椒品系接種黃瓜花葉病毒后，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素的相對含量整體上呈上升趨勢，且表明其活性與抗病性呈顯著正相關(guān)。這些報道均與本研究結(jié)果較為一致，太子參中已報道的主要病毒病類型為煙草花葉病毒以及黃瓜花葉病毒[10-11,35]，而抑菌劑中高含量的總木質(zhì)素和總生物堿對其有較好的防治效果。具體是總生物堿亦或是總木質(zhì)素中何種成分對太子參病毒病具有抑制作用，還有待進(jìn)一步的試驗結(jié)果。

本研究采用抑菌劑單用，以及抑菌劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用的措施，在防治太子參病害的田間試驗中取得了較好的防治效果，但由于試驗的地塊有差異，所以2個地塊的防治效果不能完全在同一條件下進(jìn)行比較，但可以確定的是，無論是抑菌劑單用，或抑菌劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用均有推廣的可行性。

3.3 中藥復(fù)方最優(yōu)抑菌劑及抗病毒劑聯(lián)用在其他作物上推廣運(yùn)用

2019年在貴州遵義市運(yùn)用中藥復(fù)方技術(shù)處理‘紅顏’草莓，表現(xiàn)最好的為配方一處理，在苗期和大棚均施用或僅大棚施用，成活率和預(yù)防病害表現(xiàn)最佳。

本研究結(jié)果可用于抗性繁育，降低田間太子參病毒病發(fā)生率，實(shí)現(xiàn)病毒病可防可控，同時提高產(chǎn)質(zhì)量。本研究為太子參全生育期提供病毒病防控技術(shù)保障，同時也為中醫(yī)理論在植物領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

抑菌劑1號及3號對預(yù)防太子參真菌及細(xì)菌性病害，防控已經(jīng)發(fā)生的病毒病，提升產(chǎn)質(zhì)量具有顯著效果，其中抑菌劑1號效果最佳。有機(jī)級別復(fù)方病害防治制劑在病毒病治療、提高產(chǎn)量及提高太子參品質(zhì)上具有極為顯著作用。在綠色級別中，將復(fù)方1號抑菌劑及抗病毒劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用，也能取得較好綜合表現(xiàn)，有助于形成有機(jī)及綠色級別太子參病害綜合防控技術(shù)體系。