高飛 武志鵬 阮一華

1安陽(yáng)市人民醫(yī)院眼科 455001；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科 450052

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥，是糖尿病患者視力損害和盲的主要原因[1]。DR的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)多因素相互作用的過(guò)程，其中糖尿病患者血液成分改變所引起的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度凋亡起著一定的作用[2]。目前研究已發(fā)現(xiàn)DR與高葡萄糖水平誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管損傷有關(guān)[3]。視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠維持血-視網(wǎng)膜屏障的穩(wěn)定性，在保護(hù)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的完整性和良好的視覺(jué)功能方面發(fā)揮著重要作用。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有調(diào)節(jié)功能的非編碼RNA，其可通過(guò)調(diào)控靶基因或信號(hào)通路參與生物發(fā)育、細(xì)胞增生和凋亡等生理過(guò)程[4-5]。miR-146a已被證實(shí)參與糖尿病腎病、糖尿病眼病、糖尿病性心臟病等多種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[6-7]。且已有研究顯示，DR患者血清中miR-146a的表達(dá)明顯降低，提示miR-146a可能參與DR的發(fā)生和發(fā)展[8]，但其具體作用機(jī)制尚未完全明確。本研究探討miR-146a對(duì)高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其分子機(jī)制，以期為DR的發(fā)病機(jī)制以及治療方法研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs)及其專用細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM)(美國(guó)Sciencell公司)；胎牛血清、D-葡萄糖、Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Gibco公司)；Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)；miR-146a mimics及對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照mimics control(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；SYBR premix Ex Taq試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)(美國(guó)Sigma公司)；Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(日本Takara公司)；細(xì)胞裂解液RIPA、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天技術(shù)研究所)；PVDF膜、超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Millipore公司)；兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 related X protein，Bax)單抗(AM009)、兔抗人B細(xì)胞淋巴因子2(B-cell lymphoma factor-2，Bcl-2)單抗(AM010)、兔抗人β肌動(dòng)蛋白(β-actin)單抗(AK348)、兔抗人核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor，NF)-κB p65單抗(AN365)、兔抗人p-NF-κB p65單抗(AN371)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(A0516)(美國(guó)CST公司)。UV752N型紫外分光光度計(jì)(濟(jì)南童鑫生物科技有限公司)；Mic-4型PCR儀(上海之江生物科技股份有限公司)；E-Gel Imager型凝膠成像儀、Attune NxT型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HRMECs接種到含體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清、100 U/ml(商品單位)青霉素和100 μg/ml鏈霉素的ECM培養(yǎng)基中，放置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔1天更換1次新鮮培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HRMECs用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a及實(shí)驗(yàn)分組 將HRMECs接種到24孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合達(dá)50%～60%時(shí)，參照Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，以無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2遍，加入250 μl無(wú)血清培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為高糖+miR-146a擬似物組和高糖+擬似物對(duì)照組，分別將Lipofectamine 2000(8 μl)與miR-146a mimics或mimics control(4 μl)混合加入培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h后更換含血清的培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后24 h均在培養(yǎng)基中添加25 mmol/L D-葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)取正常細(xì)胞分為高糖組和正常對(duì)照組，于高糖組培養(yǎng)基中添加25 mmol/L D-葡萄糖，正常對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)基中D-葡萄糖濃度為5.5 mmol/L。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后分別收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-146a的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-146a表達(dá) 取各組培養(yǎng)48 h的HRMECs，用Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。miR-146a正向引物：5’-CGGATCCTTGGTCTCCTCCAGAT GTTTTAT-3’；反向引物：5’-CCTCGAGTCATTAAAG TGATTTTCTCCCAAG-3’。U6正向引物：5’-CTCGCT TCGGCAGCACATA-3’；反向引物：5’-GTGCAGGGT CCGAGGT-3’。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：SYBR premix Ex Taq 12.5 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、熒光探針溶液1.0 μl、cDNA模板2.0 μl、ddH2O 8.5 μl，共25.0 μl。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火及延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增生活力 將HRMECs以5×103/孔接種到96孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)，按照1.2.2的方法分組處理，處理后48 h向細(xì)胞中加入10 μl MTT溶液，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，再向每孔細(xì)胞中加入100 μl二甲基亞砜，室溫下振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔細(xì)胞在波長(zhǎng)450 nm處吸光度(A)值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力，細(xì)胞活力(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，離心半徑6 cm，12 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，加入適量結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取100 μl細(xì)胞懸液，依次加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染液各5 μl輕輕混勻，于室溫下避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算各組HRMECs的凋亡率。

1.2.6Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá) 胰蛋白酶消化收集各組高糖培養(yǎng)48 h的HRMECs，加入300 μl RIPA細(xì)胞裂解液，低溫下提取細(xì)胞中總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白樣品上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。將PVDF膜放置在質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，分別加入一抗Bax(1∶ 500)、Bcl-2(1∶ 800)、β-actin(1∶ 500)、NF-κB p65(1∶ 500)、p-NF-κB p65(1∶ 500)，4 ℃孵育過(guò)夜；PBST洗膜后，加入相應(yīng)二抗(1∶ 3 000)，室溫下孵育2 h；PBST洗膜后，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算各組細(xì)胞中目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，均以mean±SD表示，組間均數(shù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)證實(shí)方差齊。采用均衡分組單因素干預(yù)多水平研究設(shè)計(jì)，正常對(duì)照組、高糖組、高糖+擬似物對(duì)照組和高糖+miR-146a擬似物組間各檢測(cè)指標(biāo)總體差異比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HRMECs中miR-146a相對(duì)表達(dá)量比較

正常對(duì)照組、高糖組、高糖+擬似物對(duì)照組和高糖+miR-146a擬似物組間細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=112.778，P<0.001)。與高糖組和高糖+擬似物對(duì)照組比較，高糖+miR-146a擬似物組HRMECs中miR-146a相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與正常對(duì)照組比較，高糖組HRMECs中miR-146a相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

2.2 各組HRMECs活性比較

正常對(duì)照組、高糖組、高糖+擬似物對(duì)照組和高糖+miR-146a擬似物組間細(xì)胞活力總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.465，P=0.003)。與正常對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖組和高糖+擬似物對(duì)照組比較，高糖+miR-146a擬似物組HRMECs活力明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、高糖組、高糖+擬似物對(duì)照組和高糖+miR-146a擬似物組間細(xì)胞凋亡率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.106，P<0.001)。與正常對(duì)照組比較，高糖組HRMECs凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖組和高糖+擬似物對(duì)照組比較，高糖+miR-146a擬似物組HRMECs凋亡率明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1，圖1)。

表1 各組細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量、細(xì)胞活力及凋亡率比較(mean±SD)

圖1 各組HRMECs流式細(xì)胞圖 高糖組細(xì)胞凋亡率高于正常對(duì)照組，高糖+miR-146a擬似物組細(xì)胞凋亡率低于高糖組和高糖+擬似物對(duì)照組 miR-146a：微小RNA-146a

2.4 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白、NF-κB p65蛋白表達(dá)及其磷酸化水平比較

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、高糖組、高糖+擬似物對(duì)照組和高糖+miR-146a組細(xì)胞中Bax、Bcl-2和p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.902、39.810、72.694，均P<0.01)。與正常對(duì)照組比較，高糖組HRMECs中Bax和p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與高糖組和高糖+擬似物對(duì)照組比較，高糖+miR-146a擬似物組HRMECs中Bax和p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。各組HRMECs中NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.106，P=0.955)(圖2，表2)。

圖2 各組HRMECs中Bax、Bcl-2、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)電泳圖 與正常對(duì)照組比較，高糖組HRMECs中Bax和p-NF-κB p65蛋白條帶明顯增強(qiáng)，Bcl-2蛋白條帶明顯減弱；與高糖組和高糖+擬似物對(duì)照組比較，高糖+miR-146a擬似物組HRMECs中Bax和p-NF-κB p65蛋白條帶明顯減弱，Bcl-2蛋白條帶明顯增強(qiáng)，各組NF-κB p65蛋白條帶無(wú)明顯變化 1：正常對(duì)照組；2：高糖組；3：高糖+擬似物對(duì)照組；4：高糖+miR-146a擬似物組 Bax：Bcl-2相關(guān)X蛋白；Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤因子-2；NF-κB：核轉(zhuǎn)錄因子-κB；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白

3 討論

DR的病理機(jī)制復(fù)雜，了解其發(fā)病機(jī)制有助于DR新型治療策略的研發(fā)。越來(lái)越多的研究表明，miRNA在DR發(fā)病中發(fā)揮重要作用，可能成為新的治療靶點(diǎn)[9-11]。Lee等[12]研究顯示，2型糖尿病患者的腎小球中miR-146a表達(dá)水平降低，且其表達(dá)水平與白蛋白尿和腎小球損傷程度相關(guān)，表明miR-146a在預(yù)防糖尿病性腎小球病和足細(xì)胞損傷方面具有新的作用。Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a可調(diào)節(jié)葡萄糖誘導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜和腎臟中炎性細(xì)胞因子細(xì)胞外基質(zhì)蛋白上調(diào)，提示miR-146a可能在DR和糖尿病腎病中發(fā)揮重要作用。Lu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)高血糖可引發(fā)HRMECs凋亡，從而促進(jìn)DR的進(jìn)展。然而，miR-146a對(duì)HRMECs凋亡途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。本研究探索高糖條件下miR-146a高表達(dá)對(duì)細(xì)胞活力和凋亡、凋亡相關(guān)蛋白以及NF-κB p65蛋白磷酸化的影響。本實(shí)驗(yàn)參考以往文獻(xiàn)[15-16]，采用濃度為25 mmol/L D-葡萄糖干預(yù)HRMECs，以建立DR體外細(xì)胞模型。本研究結(jié)果顯示，高糖處理后HRMECs中miR-146a的表達(dá)顯著下調(diào)，細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡增加，而通過(guò)轉(zhuǎn)染HRMECs高表達(dá)miR-146a可部分逆轉(zhuǎn)高糖所致的細(xì)胞活力降低和細(xì)胞凋亡。Kim等[17]研究結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下培養(yǎng)HRMECs細(xì)胞中凋亡關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Bcl-2表達(dá)下調(diào)，與本研究結(jié)果一致。且本研究結(jié)果顯示miR-146a過(guò)表達(dá)可部分恢復(fù)高糖誘導(dǎo)HRMECs中Bax的表達(dá)升高及Bcl-2的表達(dá)降低，推測(cè)miR-146a可抑制HRMECs凋亡。

已有研究顯示，在人單核細(xì)胞、脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞及人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中，miR-146a與NF-κB之間存在相互調(diào)節(jié)作用[18-20]。本研究結(jié)果顯示，HRMECs中miR-146a過(guò)表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活，提示miR-146a可負(fù)向調(diào)節(jié)高糖環(huán)境下HRMECs中NF-κB的活性。NF-κB和Bcl-2家族成員在細(xì)胞凋亡反應(yīng)的調(diào)節(jié)中存在密切關(guān)系，故推測(cè)miR-146a可能通過(guò)NF-κB途徑調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)，從而抑制HRMECs凋亡。本實(shí)驗(yàn)尚存在一些不足，如未檢測(cè)Bax、Bcl-2、NF-TNRB p65和p-NF-TNRB p65基因的表達(dá)，且未檢測(cè)其他信號(hào)通路變化，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)此進(jìn)行補(bǔ)充和驗(yàn)證。此外，本實(shí)驗(yàn)只涉及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在體實(shí)驗(yàn)，后續(xù)將進(jìn)行在體研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果表明高糖可抑制HRMECs中miR-146a的表達(dá)，降低細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而過(guò)表達(dá)miR-146a可部分逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的此現(xiàn)象，該過(guò)程可能與抑制NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明高飛、阮一華參與本研究選題，實(shí)驗(yàn)過(guò)程及論文撰寫(xiě)；武志鵬參與選題，實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)及論文修改和定稿。