呂明帥，趙博，孫文玉，萬水晶，劉春延，張國財

(東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040)

黑木耳(Auriculariaauricula)，是我國栽培的主要食用菌之一，具有較高的食用和藥用價值[1]。多糖作為黑木耳中重要的活性化合物之一，具有抗氧化、降血脂、抗腫瘤及增強免疫力的作用[2-3]。硒是維持人體健康的必需微量元素[4]，適當(dāng)?shù)奈匮a充可提高機體的抗氧化水平和免疫力。多糖硒是硒在食用菌中一種重要的賦存形式[5]。研究表明，黑木耳具有較強的富硒能力，多糖與硒結(jié)合成為多糖有機硒化合物，更易被人體吸收[6]。近年來已開發(fā)出多種黑木耳制成的保健食品及調(diào)味品，如黑木耳飲料、黑木耳香辣醬、黑木耳果醋、黑木耳即食品等[7-10]。因此，開發(fā)富硒黑木耳多糖膳食補充劑具有廣闊的應(yīng)用前景。

多糖的提取、分離純化是研究多糖構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)，只有相對純度較高的多糖組分，才能更好地分析其結(jié)構(gòu)，從而探究其重要的生物活性[11]。然而，目前對于富硒黑木耳多糖的研究均集中于粗多糖的體外抗氧化活性分析[12]，且對其體內(nèi)抗氧化活性的研究未見報道，富硒黑木耳多糖理化性質(zhì)和生物活性關(guān)系的探索有待進一步研究。

因此，本文利用超聲波輔助提取法對富硒黑木耳多糖進行提取，對提取的多糖進行了分離純化，進而與普通黑木耳多糖相應(yīng)級分的物化特性和抗氧化活性進行了比較分析，探究其活性機制，為富硒黑木耳的綜合開發(fā)利用提供了理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒黑木耳子實體：吉林省白石山林業(yè)局提供；清潔級BALD/C小白鼠：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、硒標(biāo)準(zhǔn)品、2,3-二氨基萘：美國Sigma公司；總還原能力試劑盒、抗羥基自由基試劑盒、ABTS自由基試劑盒、MDA試劑盒、T-SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒：南京建成生物工程研究所；單糖標(biāo)準(zhǔn)品：Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；其余化學(xué)試劑均為分析純(AR)。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-420數(shù)顯三用恒溫水浴鍋 常州申光儀器有限公司；JY92-IIDN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-5100紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；DBS-100電腦全自動部分收集器 上海滬西分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 富硒黑木耳多糖的提取

以亞硒酸鈉為硒源，用硒添加量為20 mg/kg的培養(yǎng)料栽培黑木耳，將栽培得到的富硒黑木耳子實體粉碎過80目篩。參照參考文獻[13]，采用超聲輔助法(水浴時間為2.3 h，超聲時間為30 min，料液比1∶57 (m/V)進行提取，提取后的樣品在8500 r/min條件下離心10 min，抽上清液，采用Sevage法除去蛋白，80%乙醇醇沉，離心后分別用丙酮、乙醚、乙醇洗滌沉淀，透析(截留量10 kDa)72 h，凍干，得富硒黑木耳粗多糖。普通黑木耳采用上述相同工藝流程進行提取。

1.3.2 富硒黑木耳粗多糖的純化及理化特性分析

1.3.2.1 富硒黑木耳粗多糖的純化

將DEAE-52纖維素預(yù)處理并裝柱(2.8 cm×65 cm)，取富硒與普通黑木耳粗多糖各20 mg于10 mL蒸餾水充分溶解，加入柱內(nèi)。采用恒流泵上樣，0～1 mol/L NaCl梯度洗脫，流速設(shè)為1 mL/min，從而分離不同的多糖組分。將收集液體透析(截留量10 kDa)72 h，濃縮，凍干，得到富硒及普通黑木耳多糖相應(yīng)組分。進一步利用Sephacryl S-400柱(1.6 cm×50 cm)分離純化，流速設(shè)定為0.15 mL/min，得富硒及普通黑木耳純多糖相應(yīng)級分[14]。

1.3.2.2 多糖硒含量的測定

采用熒光分光光度法對樣品多糖硒含量進行測定[15]。線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：m=15042n+149.27(m為熒光讀數(shù)；n為試管中硒含量，μg)，r2=0.9996，線性范圍為0～0.5 μg。多糖硒含量按公式(1)計算：

(1)

式中：mx為多糖中總硒質(zhì)量，μg；my為多糖中無機硒質(zhì)量，μg；mz為硒多糖質(zhì)量，g。

1.3.2.3 純度鑒定及分子量測定

采用高效凝膠滲透色譜法進行純度及分子量測定[16]。對標(biāo)準(zhǔn)分子量葡聚糖進行HPSEC分析，得多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.5212x+11.513(y為log10Mw，x為保留時間，r2=0.9851)。

1.3.2.4 單糖組成測定

按照趙博[17]的方法進行單糖組成分析。色譜柱選用Agilent HP-5彈性石英毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm)，升溫程序：130 ℃保持5 min，4 ℃/min，240 ℃保持5 min，載氣N2的流速為50 mL/min，空氣為30 mL/min，H2為37 mL/min。

1.3.2.5 糖醛酸含量測定

采用間羥基聯(lián)苯比色法測定[18]，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：a=9.8114b+0.0443(a為吸光度；b為硒多糖糖醛酸含量)，r2=0.9947，糖醛酸質(zhì)量分數(shù)按公式(2)計算：

糖醛酸質(zhì)量分數(shù)/%=糖醛酸質(zhì)量/樣品質(zhì)量。

(2)

1.3.3 多糖體外抗氧化活性測定

按照試劑盒說明書測定總還原力、羥基自由基清除能力和ABTS清除能力。

1.3.4 多糖體內(nèi)抗氧化活性測定

1.3.4.1 小鼠飼養(yǎng)及給藥

雄性BALD/C小白鼠48只，8周，體重(20±2) g，飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，濕度40%～60%，光照12 h/d，自由飲食飲水，飼料為維持性飼料。試驗前適應(yīng)生活24 h后，隨機分為8組，每組6只。分為正常對照組(N)、普通黑木耳多糖(AAP-2)低劑量組L(50 mg/(kg·d))、中劑量組M(100 mg/(kg·d))、高劑量組H(200 mg/(kg·d))、富硒黑木耳多糖(Se-AAP-2)低劑量組L(50 mg/(kg·d))、中劑量組M(100 mg/(kg·d))、高劑量組H(200 mg/(kg·d))。在為期30 d的試驗周期內(nèi)，對照組每天灌胃0.1 mL生理鹽水，試驗組每天灌胃0.1 mL對應(yīng)濃度的多糖溶液。

1.3.4.2 血清及組織的制備

試驗第29天小白鼠空腹處理，第30天摘眼取血，于4 ℃、3000 r/min條件下離心15 min，獲得血清樣品。小白鼠脫頸處死后，摘取肝、腎、心等器官，用預(yù)冷生理鹽水充分沖洗，分析天平稱重，按1∶10 (m/V)加入冷生理鹽水，冰浴研磨后在4 ℃，8000 r/min條件下離心15 min，獲得組織勻漿。將組織勻漿及血清置于-80 ℃冰箱中保存。肝、腎、心及血清的MDA含量、T-SOD及GSH-Px活性均按照試劑盒說明書進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，并進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒對黑木耳多糖物理化學(xué)特性的影響

2.1.1 DEAE-52纖維素柱純化

DEAE-52纖維素層析柱對黑木耳多糖的分離效果較好，隨著NaCl溶液濃度的逐漸增加，富硒及普通黑木耳多糖在純化后均得到2個多糖組分，各組分峰的峰形對稱(見圖1中a和b)，由于第1組分量均較少，故收集第2組分以供Sephacryl S-400柱純化。

圖1 普通黑木耳多糖(a)和富硒黑木耳多糖(b)DEAE-52洗脫曲線

2.1.2 Sephacryl S-400柱純化

經(jīng)過DEAE-52分離后得到的組分經(jīng)過Sephacryl S-400層析柱，均顯示單一對稱峰(見圖2中a和b)，純化效果明顯，純化后的富硒黑木耳多糖為Se-AAP-2、普通黑木耳多糖為AAP-2。

圖2 普通黑木耳多糖純化組分(a)和富硒黑木耳多糖純化組分(b)Sephacryl S-400洗脫曲線

2.1.3 多糖的物理化學(xué)特性

AAP-2與Se-AAP-2均呈現(xiàn)單一峰，即所得多糖為均一多糖組分(見圖3中a和b)。

圖3 普通黑木耳硒多糖純化組分(a)、富硒黑木耳硒多糖純化組分(b)的HPSEC圖譜

由表1可知，AAP-2和Se-AAP-2中硒含量分別為0.2 μg/g和1.67 μg/g, 二者相差8.35倍(P<0.01)，說明硒已成功富集于AAP-2分子中。對兩種多糖糖醛酸含量的測定結(jié)果表明，AAP-2組分的糖醛酸含量為18.36%，Se-AAP-2組分為24.55%，差異顯著(P<0.01)，由此可知，富硒可以顯著提高黑木耳多糖糖醛酸含量，這與Ye等[19]的測定結(jié)果相一致。高效凝膠排阻滲透色譜分析表明AAP-2與Se-AAP-2均為多糖均一組分。經(jīng)計算得到，AAP-2與Se-AAP-2分子量分別為634.85 kDa和485.48 kDa，存在顯著差異(P<0.01)。單糖組成分析結(jié)果表明，AAP-2和Se-AAP-2均由甘露糖和葡萄糖組成。其中，AAP-2的摩爾比為甘露糖∶葡萄糖為1∶1.28，Se-AAP-2摩爾比為甘露糖∶葡萄糖為1∶1.31，摩爾比接近，且二者差異不顯著(P>0.01)，說明富硒并未對黑木耳多糖AAP-2產(chǎn)生顯著影響。

表1 普通黑木耳硒多糖與富硒黑木耳硒多糖物理化學(xué)特性分析

2.2 體外抗氧化活性比較分析

2.2.1 總還原力測定

兩種多糖均具有一定的還原能力，且隨著濃度的增加其吸光值亦不斷提升，呈顯著的濃度依賴性(見圖4中a)。當(dāng)質(zhì)量濃度為20 mg/mL時，AAP-2和Se-AAP-2的吸光值分別為0.402和0.448，吸光值增加了11.4%。富硒后的多糖總還原能力顯著提升(P<0.05)。多糖的總還原力越強，其抗氧化活性也會提高[20]。

圖4 黑木耳多糖體外抗氧化能力測定

2.2.2 羥基自由基清除能力測定

當(dāng)質(zhì)量濃度在2～13 mg/mL時，不同質(zhì)量濃度的富硒黑木耳多糖和未富硒黑木耳多糖對·OH均有較好的清除能力(見圖4中b)，且隨著質(zhì)量濃度的增加，清除率逐漸上升，當(dāng)達到13 mg/mL時，富硒多糖和普通多糖對·OH的清除率分別為63.27%和55.57%，富硒后黑木耳多糖的清除率提高了8.6%。Se-AAP-2和AAP-2清除·OH的IC50值分別為5.66 mg/mL和8.05 mg/mL，IC50值降低了42.2%，差異顯著(P<0.05)，IC50的值越小，說明多糖的活性越強。

2.2.3 ABTS自由基清除能力測定

當(dāng)兩種多糖的質(zhì)量濃度在0～20 mg/mL范圍內(nèi)時，具有一定的劑量依賴性，濃度越高對ABTS自由基的清除能力越強(見圖4中c)。在20 mg/mL時，Se-AAP-2和AAP-2的清除率達到最高，分別為81.26%和72.13%，Se-AAP-2的清除率提高了9.13%。Se-AAP-2和AAP-2清除ABTS的IC50值分別7.26 mg/mL和9.17 mg/mL，富硒后黑木耳多糖的IC50值降低了26.4%，差異顯著(P<0.05)，即富硒黑木耳多糖對ABTS自由基的清除能力強于普通黑木耳多糖。

2.3 體內(nèi)抗氧化活性比較分析

由表2可知，與AAP-2的空白對照組相比，AAP-2和Se-AAP-2的MDA含量顯著降低，說明黑木耳多糖對小鼠臟器及血清具有緩解作用。AAP-2和Se-AAP-2各組的MDA含量都隨著多糖濃度的增大而降低。當(dāng)多糖濃度相同時，Se-AAP-2含量均低于AAP-2。但在肝中，只有在高濃度處理時，二者存在顯著差異(P<0.05)，說明富硒后的黑木耳多糖對小鼠肝臟有更好的緩解作用。在腎中，在中、高濃度處理時二者存在顯著差異(P<0.05)。在心中，低濃度與對照組不存在顯著性差異，只有在高濃度時二者存在顯著差異(P<0.05)。在血清中，只有在高濃度時二者存在顯著差異。此結(jié)果說明富硒后的黑木耳多糖對肝和腎的緩解作用更為明顯，心和血清只有在高濃度時緩解作用顯著。

表2 普通黑木耳硒多糖與富硒黑木耳硒多糖體內(nèi)抗氧化活性分析

續(xù) 表

與AAP-2的空白對照組相比，AAP-2和Se-AAP-2的T-SOD活性顯著提高。AAP-2和Se-AAP-2各組的T-SOD活性都隨著多糖濃度的增大而提高。當(dāng)多糖濃度相同時，Se-AAP-2活性均高于AAP-2。但在腎和血清中，只有在高濃度處理時二者存在顯著差異(P<0.05)，說明在低濃度時二者對小鼠腎和血清的促進作用沒有顯著性差異。在肝和心中，在不同濃度下，二者均存在顯著差異(P<0.05)。此結(jié)果說明富硒后的黑木耳多糖對肝和心的促進作用更為明顯，腎和血清只有在高濃度時促進作用顯著。

與AAP-2的空白對照組相比，AAP-2和Se-AAP-2的GSH-Px活性顯著提高。AAP-2和Se-AAP-2各組的GSH-Px活性都隨著多糖濃度的增大而提高。在肝、腎和心中，在相同濃度時，二者均存在顯著性差異(P<0.05)，說明富硒黑木耳多糖對小鼠肝、腎和心的促進作用更為明顯。在血清中，在低、中濃度時二者沒有顯著性差異，只有在高濃度處理時二者存在顯著差異(P<0.05)。此結(jié)果說明富硒黑木耳多糖對小鼠肝、腎和心的促進作用優(yōu)于普通黑木耳多糖，血清只有在高濃度時促進作用顯著。

3 結(jié)論

抗氧化是多糖主要的生物活性之一[21]，供氫或電子傳遞能力的強弱決定了多糖的抗氧化活性[22-23]。大量研究證實，多糖的抗氧化活性是多種因素共同作用的結(jié)果，其中分子量、單糖組成、糖醛酸含量與其抗氧化活性關(guān)系十分密切[24-25]。通常，相比高分子量多糖，低分子量多糖因具有與自由基接觸的更大機會而具有更高的抗氧化活性[26-27]。同時，糖醛酸的羧基作為活潑的氫供給基團，可通過供氫清除自由基，使其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的化合物而阻斷氧化連鎖反應(yīng)，進而賦予多糖較強的抗氧化活性[28-29]。在體外抗氧化試驗中，Se-AAP-2的總還原力、羥基自由基及ABTS自由基清除能力均優(yōu)于AAP-2，這可能是由于Se-AAP-2具有較低的分子量和較高的糖醛酸含量[30]，與Li等比較富硒和普通灰樹花子實體多糖的結(jié)果相一致[31]。在體內(nèi)抗氧化試驗中，MDA作為一種醛類物質(zhì)，可以改變生物大分子的活性。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，在胞漿內(nèi)通過分解H2O2起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的作用。T-SOD則通過歧化O2-形成H2O2，而H2O2在GSH-Px的作用下分解為水，從而達到消除自由基的作用[32]。Se-AAP-2顯著提升了T-SOD、GSH-Px的抗氧化活性，降低了MDA含量，可能是因為隨著體內(nèi)硒多糖的代謝，多糖中的硒參與了GSH-Px的合成，從而使得富硒后的黑木耳多糖體內(nèi)抗氧化活性優(yōu)于普通黑木耳多糖。此外，研究表明多糖中硒的存在還可激活其異頭碳區(qū)域的氫原子，從而提高其抗氧化活性[33-34]，這也可能是Se-AAP-2抗氧化能力得到顯著提升的重要因素。

本文采用超聲輔助提取法對富硒黑木耳多糖進行提取。利用DEAE-52纖維柱和Sephacryl S-400柱分別從富硒黑木耳硒多糖和普通黑木耳多糖中獲得相應(yīng)級分的Se-AAP-2與AAP-2。物化特性和抗氧化活性對比分析結(jié)果表明，富硒并未對AAP-2的單糖組成及摩爾比產(chǎn)生顯著影響，硒基團的賦存、分子量的降低及糖醛酸含量的提高可能是導(dǎo)致Se-AAP-2抗氧化活性高于AAP-2的主要原因。