陳嘉序，陳如揚，連媛，姚欣碩，黃鈺昕，高瑤，肖愈

（湖南農業(yè)大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128）

大豆異黃酮（soybean isoflavone）是一類重要的非固醇類功能活性物質，具有較好的抗癌作用、預防骨質疏松癥及降低心血管疾病發(fā)病率等功能，現(xiàn)已被廣泛運用于食品保健、飼料研發(fā)、醫(yī)藥制品等諸多領域。自1931年，Walz等首次從大豆中分離提取出大豆異黃酮——染料木素（genistein）以來[1]，目前發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮已有12種，主要以結合型糖苷（glucoside）和游離型苷元（aglycone）2種形式存在，其中97%左右為以β-葡萄糖苷形式存在的糖苷及其衍生物。大豆異黃酮的生物活性與化學結構息息相關，游離型苷元在人體內吸收程度遠高于結合型糖苷，并具有更高的類雌激素活性和抗氧化活性[2]。現(xiàn)階段常通過酸解、酶解、物理輔助提取等方式提高大豆總異黃酮中糖苷向苷元轉化的效率，但存在生產效率低，反應條件苛刻等諸多弊端，不適于大規(guī)模應用[3]。近年來，微生物發(fā)酵已廣泛應用于糖苷型異黃酮向更利于吸收利用的各級異黃酮的生物轉化中，如利用Actinomucor elegans、Rhizopus oligosporus和Bifidobacterium等食品發(fā)酵使用菌種以及Escherichia coli和Lactobacillus等腸道微生物群，研究對豆制品加工主要大豆異黃酮單體含量以及最終代謝產物生物活性的影響。此類微生物在發(fā)酵時能產生作用于糖苷型異黃酮7-位氧苷鍵的酶，游離型異黃酮含量顯著增加[4-5]，通過不同的代謝途徑轉化為諸多高活形式、無活性產物甚至潛在毒性物質[6]。本文擬就近年來有關實際生產使用的菌種及腸道菌群對大豆異黃酮單體的代謝轉換作用以及其不同代謝產物生物活性功能的相關研究進行梳理，以期為深入研究大豆異黃酮的微生物轉換及新型功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 大豆異黃酮的代謝

大豆異黃酮通常以糖苷的形式存在于自然界中，由酚羥基和糖基縮合而成，其結構通式是以3-苯并吡喃酮為母核的化合物群（圖1）。

圖1 結合型糖苷和游離型苷元的結構通式Fig.1 General formula of glycosides and aglycone

不論是在發(fā)酵食品基質還是腸道環(huán)境下發(fā)生的生物轉化過程，大豆異黃酮轉化的第一步都是糖苷型分解為苷元型。1995年，Matsuura等[7]在發(fā)酵豆制品中先檢測到了β-葡萄糖苷酶-C的活性，同時分離純化得到了酶蛋白，在體外發(fā)酵過程中驗證了大豆異黃酮的轉化首先是糖苷酶的作用。Hur等[8]從健康個體的糞便細菌中篩選涉及大豆異黃酮代謝的特定細菌，其測定的轉化結果也證明了這一點。在微生物分解酶的作用下，結合型大豆異黃酮的糖苷鍵裂解釋放出葡萄糖配基和苷元，糖苷鍵水解包括以下一系列過程：位于R3位置的官能團丙二酰基乙?；D化為乙酰基，乙?；又D化為H，最后β葡萄糖苷型在β-葡糖糖苷酶的作用下轉化為游離型苷元[9]。

在苷元型異黃酮形成的基礎上，大豆苷元和染料木素的一種單羥基化代謝物在C環(huán)的C-2脂肪族位置被羥基化。然而單羥基化代謝物并不是氧化代謝的終產物，Kulling等[10]使用大鼠肝臟微粒體進行體外實驗研究得到大豆苷元被轉化為9種代謝物，包括4種單羥基化、4種二羥基化和1種三羥基化的代謝物，主要產物被鑒定為 6，7，4′-三羥基異黃酮、6，7，3′，4′-四羥基異黃酮、7，8，4′-三羥基異黃酮和 5，6，7，4′-四羥基異黃酮；染料木素被代謝為4種單羥基化產物和2種二羥基化產物，主要產物為5，6，7，4′-四羥基異黃酮和 5，7，8，4′-四羥基異黃酮。Heinonen 等[11]研究所得黃豆黃素的公認代謝產物為二氫黃豆黃素（dihydroglycitein）、6-甲氧基-雌馬酚（6-methoxy-equol）、5′-methoxy-O-desmethylangolensin、6-羥基-大豆苷元（6-hydroxy-daidzein）、6-羥基-二氫黃豆苷元（6-OH-dihydrodaidzein）、6-羥基-雌馬酚（6-hydroxy-equol）以及5′-羥基-去氧甲基安哥拉紫檀素（5′-hydroxy-O-desmethylangolensin）。但值得一提的是，在大豆苷元的代謝途徑中也可以出現(xiàn)上述部分產物，而Heinonen等在研究中并未使用示蹤法或純化合物，在母體化合物和代謝物之間無法建立明確的聯(lián)系[12]。

1.1 發(fā)酵制品中微生物對大豆異黃酮的代謝轉化

自20世紀末期，人類開始研究對大豆異黃酮的代謝轉化有不同成效的特定微生物菌株。微生物代謝轉化體系現(xiàn)已成為食品大規(guī)模生產、藥物發(fā)現(xiàn)等相關領域獲取大豆異黃酮高活性產物的一種常用方法。迄今國內外已報道的能將大豆異黃酮代謝轉化為各類代謝產物的細菌菌株多為Clostridium、Sneckeria、Bifidobacterium、Coriobacteriaceae和Lactobacillus等[13]。發(fā)酵過程中微生物在β-葡萄糖苷酶的水解作用下極大地改變了大豆異黃酮的組分和含量，未發(fā)酵前大豆異黃酮主要是結合型糖苷，發(fā)酵后糖苷型含量減少，游離型苷元增加，同時產生了一系列代謝產物。

例如，Bifidobacterium在提高豆?jié){的生物活性方面起著重要作用，尤其是對大豆異黃酮的生物轉化已得到廣泛報道[14-15]。Wei等[14]以乳桿菌和雙歧桿菌為菌種發(fā)酵豆?jié){，研究發(fā)現(xiàn)50%以上的結合型都被轉化為游離型異黃酮。Raimondi等[15]發(fā)現(xiàn)它們具有將大豆苷轉化為大豆苷元的能力。大多數(shù)菌株從大豆苷中釋放糖苷配基，其中有12種菌株的產率高于90%。在豆?jié){發(fā)酵生產過程中，Bifidobacterium產生許多糖基水解酶，它們水解寡糖和與糖結合的化合物，將糖苷型異黃酮進行生物轉化為相應的生物活性代謝產物，釋放苷元型異黃酮的能力具體取決于β-葡萄糖苷酶。然而，Bifidobacterium對于大豆苷元向代謝產物S-雌馬酚（S-equol）的轉化目前仍然存在爭議，大豆苷元向S-雌馬酚的轉化通過二氫黃豆苷元和四氫黃豆苷元或脫氫雌馬酚的還原途徑發(fā)生，但尚未有報道明確表明Bifidobacterium可進行此過程完整的還原生物轉化。

事實上，我國許多傳統(tǒng)特色發(fā)酵豆制品如腐乳、豆豉等在工業(yè)生產中，微生物體系的建立是決定產品品質的重中之重。腐乳是以豆腐為原料，通過微生物復合發(fā)酵制成的一種植物奶酪型食品，國內學者對其中的大豆異黃酮動力學變化進行了諸多探討。劉欣等[16]分別以 Actinomucor elegans、Mucor wutungkiao 和 Rhizopus oligosporus為菌種，研究不同菌種在腐乳發(fā)酵前后大豆異黃酮含量變化。研究表明前發(fā)酵過程中，大豆異黃酮含量均有所增加且Rhizopus oligosporus前發(fā)酵腐乳大豆異黃酮含量相較于Mucor wutungkiao和Actinomucor elegans分別高90%和133%。這是由于除了菌種分泌的β-葡萄糖苷酶等酶類，使豆腐坯中配糖體形式異黃酮轉化為游離形式外，可能還存在一些成分與大豆異黃酮相互轉化，使得異黃酮含量上升[17]。

此外，微生物在發(fā)酵黃漿水、豆渣等豆制品副產物的工業(yè)過程中，也發(fā)揮了舉足輕重的作用。王麗夏[18]利用Cordyceps militaris SN-18發(fā)酵黃漿水，結果表明，大豆異黃酮的總量和游離型的苷元含量均顯著上升，特別是在80%乙醇提取物中，大豆苷元、黃豆黃素和染料木素分別增至（7 571.87±329.12）、（1 372.58±93.97）、（4 726.94±126.99）μg/g，分別是未發(fā)酵前的 20.5、16.5 和18.7倍。還有研究人員以Lactobacillusplantarum和Diplococcuspentosus為菌種，按照接菌量5.59%發(fā)酵黃漿水，得游離型苷元含量為31.31 mg/L，相比未發(fā)酵黃漿水增加了29.77 mg/L[19]。Lee等[20]以 Aspergillus niger為試驗菌種探究其對異黃酮的轉化產物，結果發(fā)現(xiàn)在初期代謝產物多為單羥基異黃酮和二羥基異黃酮，發(fā)酵10 d代謝產物多為二羥基異黃酮和三羥基異黃酮，羥基化反應通常發(fā)生在異黃酮的B環(huán)中。經標準驗證，在二羥基異黃酮中，除3′，4′-二羥基類似物外，大豆苷元（4′，7′-二羥基異黃酮）是最豐富的代謝物。

1.2 腸道微生物對大豆異黃酮的代謝轉化

腸道菌群是寄居在人體胃腸道內的正常微生物，不僅可以排毒清腸，減少病原菌帶來的侵害，還有利于維生素的合成。人體的健康狀況與腸道菌群同其宿主環(huán)境所共同構成的動態(tài)生態(tài)平衡密切相關。大豆異黃酮在人體內的主要代謝場所就是腸道，腸道菌群含有宿主本身不具有的結合型大豆異黃酮水解酶基因，將糖苷型代謝為游離型苷元。目前已報道的腸道菌包括 Bacteroidetes、Firmicutes、Enterococcus、Lactobacillus、Bifidobacterium和Clostridium等[21]。根據(jù)大豆異黃酮的代謝途徑分析，結合型糖苷能抵擋胃和小腸的消化作用，到達結腸時，腸道菌群產生的β-葡萄糖苷酶水解位于糖基末端非還原性的糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基[22]，從而結合型糖苷數(shù)量降低，苷元型數(shù)量上升。經報道證實，β-葡萄糖苷酶的專一性較差，在水解底物的糖基結構時，即可水解C-O糖苷鍵、C-S鍵以及C-N鍵等[23]，這種專一性為得到不同形式的大豆異黃酮提供了基礎。游離型苷元一部分被小腸直接吸收，最終以糞便的形式排出體外。另一部分則繼續(xù)被腸道菌群所分泌的黃豆苷元還原酶、二氫黃豆苷元酶、四氫黃豆苷元還原酶等酶系，通過去糖基、脫甲基、脫羥基和還原反應等分解得到活性更高的不同次級代謝產物[24]。

大腸菌群在得到苷元的基礎上可以通過加氫還原（C-2位和C-4位）、開環(huán)轉化或同時進行加氫還原（C-2位和C-4位）和去掉底物C-4位酮基的功能，將大豆苷元或染料木素還原為二氫黃豆苷元（dihydrodaidzein，DHD） 或二氫染料木素（dihydrogenistein，DHG）、開環(huán)轉化為去氧甲基安哥拉紫檀素（ODesmethylangolensin，O-Dma）和 4-羥苯基-2-丙酸[2-（4-Hydroxyphenyl）propionic acid，2-HPPA]、還原去酮基后生成雌馬酚（equol）等代謝產物[25]。Schoefer[26]及Lee等[27]先后報道了來源于人體腸道的Eubacterium，可以對游離型苷元進行開環(huán)轉化，分別將大豆苷元和染料木素代謝轉化為去氧甲基安哥拉紫檀素和4-羥苯基-2-丙酸。另有研究報道兼性好氧腸道微生物Enterococcus hirae AUH-HM195同樣具有開環(huán)轉化功能[28]。Heinonen等[29]為了探究大豆異黃酮的Ⅰ期代謝產物，召集了6名志愿者，在其每天正常的西方飲食中加入3根大豆棒，進行為期2周的補充前后尿液樣品收集。尿液樣品經一系列分離純化，使用氣相色譜-質譜法 （gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析確定了幾種新的大豆異黃酮代謝物。鑒定出4種大豆苷元和染料木素的主要代謝產物，分別是大豆苷元的 3 種羥基化代謝物 3′，4′，7-三羥基異黃酮、4′，6，7-三羥基異黃酮和 4′，7，8-三羥基異黃酮，以及染料木素的代謝產物3′，4′，5，7-四羥基異黃酮。研究表明，形成4′，6，7-三羥基異黃酮的另一種途徑是黃豆黃素的去甲基化。同時該研究也初步確定了其它先前報道的代謝產物雌馬酚、去氧甲基安哥拉紫檀素、二氫黃豆苷原和順-4-羥基-雌馬酚、二氫染料木素和6′-OH-O-desmethylangolensin的含量較低且這些氧化代謝產物的產生存在個體差異。然而除了個體差異外，在動物研究和一些人類研究中已經觀察到關于腸道菌群的性別差異。例如，Coldham和Sauer[30]報告了口服[14C]染料木素后大鼠糞便中的主要代謝產物，結果表明雌性大鼠代謝主要為二氫染料木素，雄性大鼠代謝主要為4-羥苯基-2-丙酸。通過對各類不同代謝產物的化學結構式進行分析，加上對諸多研究進行歸納總結，整理出目前普遍認可的大腸菌群對大豆異黃酮主要代謝途徑及相應發(fā)酵微生物種類（圖2）。

圖2 大豆異黃酮腸道微生物代謝轉換途徑Fig.2 Microbial metabolic pathway of soybean isoflavones by gut microbiota

2 大豆異黃酮生物轉化產物功能活性

2.1 抗氧化作用

氧化損傷對人體健康造成了極大的威脅，人體的氧化衰老主要是由氧化應激反應產生的自由基造成的。大豆異黃酮生物轉化產物能夠對人體起到多種調節(jié)作用，使細胞免受氧化應激損傷。大豆異黃酮屬于氧苷類，是雜環(huán)酚類化合物，其抗氧化活性主要取決于它們向自由基捐贈氫原子的能力，即其分子結構主鏈上取代羥基的位置和數(shù)目。有研究表明，對抗氧化活性影響最大的羥基位是C-4′位羥基，其次是C-5位羥基，而C-7位羥基的影響可以忽略[31]。而大豆苷元在C-4′位、C-5位、C-7位共3個羥基，染料木素在C-4′位和C-7位共2個羥基，所以染料木素和大豆苷元均是有效的抗氧化劑，且相對于未發(fā)酵前的大豆異黃酮母體，轉化產物具有更有效的抗氧化功能。

翟齊嘯等[32]研究發(fā)現(xiàn)利用Lactobacillus和Mould發(fā)酵豆乳，可以改變其中結合型糖苷和游離型苷元的組成比，從而有效提高豆乳因對金屬鎘暴露導致氧化損傷的保護效果。唐思頡等[33]報道，用紅茶菌發(fā)酵黃漿水，發(fā)酵6d后結合型糖苷質量濃度下降至49.76mg/mL，而游離型苷元質量濃度增加到150.95 mg/mL。同時還發(fā)現(xiàn)轉化產物對于DPPH自由基的清除能力明顯上升，從15.19%提高達93.19%。轉化產物主要是通過以下2種途徑來實現(xiàn)其抗氧化功能：第一種是在細胞代謝過程中阻止DNA中鳥嘌呤被活性物質破壞來阻斷自由基反應鏈，清除體內產生的過多的自由基，保持機體的自由基平衡[34]；第2種是通過增強相關抗氧化酶的活性，減少氧化應激代謝產物的生成。Gunae等[35]通過動物實驗研究得出，大豆異黃酮轉化產物可誘導抗氧化基因的表達，顯著提高大鼠血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）的抗氧化活性，從而減少大鼠體內丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，激活酶活性防御系統(tǒng)，減少自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成，最終減少機體氧化損傷。

2.2 抗癌活性

1986年，美國研究員首次發(fā)現(xiàn)異黃酮類化合物大豆中具有抗癌活性的有效成分，之后便掀起了國內外對大豆異黃酮生物轉化產物抗癌活性研究的熱潮[6]。大量研究已證實，經常食用富含大豆異黃酮轉化產物的人群可明顯減少相關疾病的發(fā)病風險，尤其是降低結腸癌、乳腺癌和前列腺癌等疾病的發(fā)病率[36]。如崔美林[37]利用含有菌絲體的靈芝勻漿發(fā)酵大豆異黃酮粗提物，60℃下轉化48 h后，測得大豆苷元和染料木素的轉化率分別為96.63%和87.82%，且轉化產物對結腸癌細胞HTL9、乳腺癌細胞MCF-7、肝癌細胞HepG2的增殖均有顯著的抑制效果。其原因是經轉化產物處理后，細胞HTL9和MCF-7被阻滯于G1期，無法分裂，而細胞HepG2被阻滯在S期來誘導細胞凋亡。此外，經轉化產物處理后，結腸癌細胞HTL9中Bcl-2基因/Bax基因比值下降，同時Cyto-C蛋白表達含量上升，激活半胱氨酸蛋白酶-3，半胱氨酸蛋白酶-8使其含量增加，該試驗進一步說明轉化產物可以通過調控多個與凋亡相關基因的表達，從而誘導細胞HTL9凋亡。

然而并不是所有的大豆異黃酮生物轉化產物都具有絕對的抗癌活性，有些反而會促進癌細胞增殖。如Juan等[38]利用5 μmol/L染料木素處理乳腺癌細胞MCF-7，研究表明染料木素可通過對細胞色素P450 1B1（CYP 1B1）基因的誘導，從而刺激細胞MCF-7產生ROS，并促進癌細胞MCF-7的增殖。因此，在攝入外源性大豆異黃酮轉化產物時應確定合理的攝入劑量和攝入頻率。

2.3 預防骨質疏松癥

女性在更年期時，體內雌激素水平急劇下降，骨小梁和皮質骨密度降低，繼而引發(fā)骨質疏松癥。大豆異黃酮因具有與內源性激素雌二醇相似的化學結構，可以結合受體，具有擬雌激素作用，并通過降低骨吸收速率，提高骨形成率來實現(xiàn)對骨代謝的良好調節(jié)。其中發(fā)揮主要作用的還是大豆異黃酮被腸道菌群分解的代謝物[39]。Ohtomo等[40]研究了O-Dma對于切除子宮小鼠的骨密度及生長代謝的影響，發(fā)現(xiàn)O-Dma能夠顯著抑制破骨細胞生長。另有Jin等[41]研究發(fā)現(xiàn)大豆苷元通過發(fā)揮雌激素作用，激活絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調節(jié)激酶（MEK/ERK）和磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B或PKB（PI3K/Akt）信號通路，促進人類成骨細胞樣MG-63細胞的增殖分化來刺激成骨。雌馬酚也是大豆苷元的主要代謝產物，Lin等[42]研究了雌馬酚對膠原性關節(jié)炎小鼠炎癥反應和骨侵蝕的影響，結果表明雌馬酚能抑制白細胞介素-6及其受體的表達，同時還能激活雌激素受體β的活性，降低破骨細胞和未成熟成骨細胞特異性及軟骨破壞相關基因的表達，從而預防骨質疏松癥。

2.4 其它活性

大豆異黃酮轉化產物還具有降低心血管風險、預防動脈粥樣硬化癥、抑菌、提升機體免疫力等諸多作用，在市場上呈現(xiàn)出較為廣闊的應用潛力。轉化產物主要是通過弱雌激素作用，減少血清總膽固醇濃度來緩解心血管疾病，而雌馬酚的效果最為顯著[43]。舒芙蓉[44]為高膽固醇血癥人群適量補充大豆異黃酮轉化產物，實驗表明大豆苷元可顯著減低血清甘油三酯和尿酸濃度，對于心血管疾病有一定的干預作用。此外，很早就有記載說大豆可以治療腸炎，Hong等[45]研究發(fā)現(xiàn)染料木素對 Staphylococcus aureus、Yersinia enterocolitica、Enterobacteriaceae、Mycobacterium avium、Listeria monocytogenes、Fonsecaeapedrosoi具有顯著的抑菌效果。其機制可能是通過破壞細胞結構的完整性、抑制蛋白質的合成和糖異生途徑以及使遺傳物質的合成受到阻礙來實現(xiàn)。諸多研究表明，大豆異黃酮轉化產物的功能活性還表現(xiàn)在調節(jié)機體免疫系統(tǒng)，增加免疫功能。高榮海等[46]用大豆異黃酮糖苷和苷元喂養(yǎng)小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠雞紅細胞作免疫原的溶血素光密度值較對照組均有顯著提升，表明糖苷和苷元都有免疫調節(jié)功能，同時發(fā)現(xiàn)苷元型的轉化產物吸收性更強，其調節(jié)機制主要從非特異性免疫、細胞免疫與體液免疫來完成免疫應答。

3 總結與展望

近年來，大豆異黃酮微生物轉化產物對于人體健康調控方面起到的積極作用受到了國內外研究學者們的廣泛關注，了解各類微生物對于大豆異黃酮的代謝機制及各類代謝產物有著巨大的現(xiàn)實意義。本文綜合了近年來國內外相關研究成果，針對不同微生物體系（有關實際生產發(fā)酵食品使用的微生物菌種及腸道菌群）對大豆異黃酮主要單體的代謝、轉換過程，以及代謝產物在抗氧化作用、抗癌活性和預防骨質疏松癥等生物活性的影響機制進行了詳細闡述。利用微生物發(fā)酵技術可制備具有更高、更廣活性的不同次級代謝產物，但就目前的研究深度來說，各類微生物對大豆異黃酮進行復雜代謝轉化過程時的作用條件（溫度、pH值、酶系和菌種數(shù)目等）以及各類微生物在轉化時的代謝通路和具體代謝作用機理等還有待進一步研究。只有了解以上條件和機理，才能解決市場上大豆異黃酮微生物體外轉化工藝構建的問題，才能進一步推進對大豆異黃酮微生物轉化產物功能活性的研究，為大豆異黃酮微生物轉化產物在食品保健、飼料研發(fā)、醫(yī)藥制品等諸多領域更深層次的開發(fā)利用提供理論參考依據(jù)。