陳海霞，羅楊合，龐永豐，聶輝，黃雙全，黎小椿

（賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542899）

多菌靈是常用的苯并咪唑類殺菌劑，其通過種子、根、葉吸收后在作物體內(nèi)傳導(dǎo)，起到治療和保護(hù)作用，殘留時效長。由于人們過量使用多菌靈，使得農(nóng)產(chǎn)品及其加工品受到污染，對人畜安全健康帶來負(fù)面影響，甚至導(dǎo)致環(huán)境污染。因此，建立穩(wěn)定性好、靈敏度高的蔬菜中多菌靈快檢方法對保障蔬菜質(zhì)量安全尤為重要。

近年來，蔬菜農(nóng)殘多菌靈快速檢測常用的方法有高效液相色譜法[1]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[2]、近紅外光譜法[3]、紫外吸收光譜法[4]、熒光法[5]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[6-7]。高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法樣品處理復(fù)雜，操作繁瑣；近紅外光譜法和紫外吸收光譜法易受干擾、檢測限低。與紅外、熒光等其它光譜手段相比，表面增強(qiáng)拉曼光譜法的優(yōu)點(diǎn)在于可用紅外光激發(fā)、受生物樣品自身熒光干擾更小、不受水干擾以及不易猝滅，它的檢測范圍更寬、靈敏度更高、提供更多信息等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常好的蔬菜農(nóng)殘快速檢測方法。

表面增強(qiáng)拉曼散射（surface-enhanced raman scattering，SERS）光譜是一種非破壞性、靈敏度高、選擇性好的拉曼光譜分析技術(shù)。SERS效應(yīng)是在激發(fā)區(qū)域內(nèi)，由于樣品分子吸附在一定程度粗糙表面上，使表面或近表面的電磁場的增強(qiáng)，導(dǎo)致拉曼散射信號極大增強(qiáng)（約106～1010）。SERS技術(shù)操作簡便，選擇好，不需要進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理，適用于現(xiàn)場快速檢測。它還克服了拉曼光譜精確度低、信號弱、背景干擾強(qiáng)的缺點(diǎn)，可以獲取到常規(guī)拉曼光譜難易得到的結(jié)構(gòu)信息，可以有效分析化合物在界面的吸附取向、吸附態(tài)的變化、界面信息等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于檢測農(nóng)藥殘留[8]、痕量重金屬等[9]。Shende等[10]采用SERS法檢測水果中的農(nóng)藥殘留，檢測限達(dá)10-6mol/L。Vongsvivut等[11]制備金-銀金納米溶膠作SERS基底檢測地蟲磷農(nóng)藥殘留，檢出限為10mg/mL。Tang等[12]以銀納米粒子作為基底，通過SERS技術(shù)測定三環(huán)唑和百草枯和氟硅混合農(nóng)藥，三環(huán)唑的檢出限為0.01mg/L，百草枯的檢出限為0.1mg/L，氟硅唑的檢出限為2.85 mg/L。但是，SERS活性基底的制備和方法的選擇性還有很多問題需要解決。因此，制備穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較好的SERS基底，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定的蔬菜農(nóng)殘SERS定量分析方法具有重要研究意義。

金納米（gold nanoparticles，AuNPs）是一種能與其它生物大分子結(jié)合且不影響其生物活性的納米材料。AuNPs可與氨基非共價鍵吸附，也能與巰基共價結(jié)合，因此它可以和多種生物傳感器相互結(jié)合，形成穩(wěn)定性好的納米復(fù)合探針，可以識別多種靶目標(biāo)，提高檢測的靈敏性。倪璇等[13]通過利用檸檬酸三鈉的還原性還原氯金酸制備AuNPs，建立了一種比色適配體傳感器檢測水溶液中的多菌靈的新方法，該比色法的檢測限低至2.3nmol/L，線性檢測范圍為2.3 nmol/L～800 nmol/L。陳雨等[14]使用SERS技術(shù)研究DNA-AuNPs組裝體對γ射線的輻射響應(yīng)性質(zhì)，以及金納米粒子的局域增強(qiáng)效應(yīng)對組裝體γ射線響應(yīng)的影響。蔣巧艷等[15]利用AuNPs、MoS2和鈦合金箔為材料構(gòu)建表面增強(qiáng)基底物用于敵草快（diguat dibromide，DQ）的檢測，建立了一個新穎、靈敏的SERS檢測DQ方法，結(jié)果顯示該方法的檢出限為10-13mol/L，比現(xiàn)有報道的DQ檢測方法的檢出限（10-12mol/L）低。但是，不同直徑的納米金有不同的性質(zhì)，因此，制備合適的納米金尤為重要。

適配體（aptamer，Apt）是通過指數(shù)富集系統(tǒng)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)從體外隨機(jī)單鏈DNA或RNA序列庫中篩選出來的能與靶物質(zhì)產(chǎn)生類似于抗原-抗體高特異性結(jié)合的寡核苷酸鏈。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，自1990年Ellington首次提出適配體概念后，基于其親和力及與靶物質(zhì)特異性結(jié)合能力，作為靈敏檢測農(nóng)藥殘留的新方法得到了快速發(fā)展。李鳳球等[16]提到被篩選出來并應(yīng)用于實(shí)際農(nóng)殘檢測的適配體很少，迄今為止還不足20種。聶永惠[17]以納米金溶膠為SERS活性基底，基于適配體與馬拉硫磷特異結(jié)合的能力，建立了一種簡單且針對馬拉硫磷的特異檢測的SERS的快速無損檢測方法，該法在 5×10-7mol/L～1×10-5mol/L 范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)值R2=0.992 0。胡薇薇[18]以結(jié)晶紫為探針，在啶蟲脒存在時，核酸適配體能與其發(fā)生特異性結(jié)合并不再吸附到結(jié)晶紫-金納米離子表面而使SERS信號降低的規(guī)律，構(gòu)建表面增強(qiáng)拉曼納米生物傳感器對茶葉中啶蟲脒進(jìn)行定量檢測，檢出限為0.72 nmol/L。Zourob等[19]利用SELEX技術(shù)在10輪篩選后，成功篩選出高適應(yīng)性和特異性的多菌靈DNA適配體。將該適配體經(jīng)過硫醇修飾在金電極上自組裝構(gòu)建電化學(xué)適體傳感器對多菌靈進(jìn)行檢測。由于適配體只有在一定條件下才能與其靶物質(zhì)發(fā)生特異結(jié)合，且同一適配體不能與多種靶物質(zhì)發(fā)生特異反應(yīng)，因此需要根據(jù)實(shí)際測定的目標(biāo)物選擇適宜的適配體。

目前，基于適配體的比色傳感檢測多菌靈的方法已經(jīng)建立，但是未見基于適配體與納米結(jié)合，建立SERS法檢測多菌靈的相關(guān)報道。因此，本文利用適配體的高親和力及特異結(jié)合性能，建立穩(wěn)定性高、選擇性好、快速檢測多菌靈的SERS分析方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試驗(yàn)用水均為超純水（電阻：18.25 MΩ·cm）。所用玻璃器皿均用王水浸泡，超純水清洗。

1.1.1 儀器

633 nmDXRsmart激光拉曼光譜儀：美國Thermo公司；MR-Hei-Tec加熱型磁力攪拌器：德國Heidolph公司；Evolution 300紫外可見光分光光度計：廣西金鑫進(jìn)出口有限公司；F-4600熒光分光光度計：廣西思遠(yuǎn)儀器設(shè)備有限公司；ULUP-II-40L優(yōu)普系列超純水器：四川優(yōu)普超純科技有限公司；FA2004N分析天平：上海菁海有限公司；H 1650臺式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.1.2 試劑

氯金酸（AR）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸三鈉（AR）、碳酸氫鈉（AR）、氯化鋅（AR）：成都市科龍化工試劑廠；氯化鈉（AR）：廣州化學(xué)試劑廠；維多利亞藍(lán)B（AR）：匯普化工有限公司；多菌靈適配體；生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇中多菌靈（100μg/mL）、丙酮中毒死蜱（100μg/mL）、丙酮中莠去津（100 μg/mL）、乙醇中吡蟲啉（1 000 μg/mL）：北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；氯化鋇（AR）、硫酸鉀（AR）、丙酮（AR）、乙醇（95%）：西隴科學(xué)股份有限公司；甲醇（AR）：廣東光華科技股份有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)試劑的配制

1%氯金酸（HAuCl4）溶液：將1 g氯金酸在燒杯中用超純水溶解，于100 mL棕色容量瓶定容，4℃冰箱貯藏。

1%檸檬酸三鈉溶液：稱量1 g檸檬酸三鈉，放入小燒杯中，用超純水溶解，于100 mL棕色容量瓶定容至刻度，常溫貯藏即可。

1 mol/L NaCl溶液：稱量5.58 g NaCl在燒杯中用超純水溶解，于100 mL容量瓶定容，常溫貯藏。

1×10-5mol/L維多利亞藍(lán)B溶液（victoria blue B，VBB）：稱量0.506 g維多利亞藍(lán)B在燒杯中溶解，100 mL棕色容量瓶定容，得到1×10-3mol/L VBB溶液，再逐級稀釋成1×10-5mol/L，4℃冰箱貯藏。

多菌靈標(biāo)準(zhǔn)液（carbendazim，CBZ）：量取1 mL 100 μg/mL（100 mg/L）的甲醇中多菌靈標(biāo)準(zhǔn)液，放入10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到10 mg/L的多菌靈溶液，4℃冰箱冷藏備用。

多菌靈適配體溶液：將含有18 μmol/L適配體的離心管離心（10 000 r/min）1 min，加入 100 μL 超純水繼續(xù)離心1 min，逐級稀釋成0.18 μmol/L適配體溶液，4℃冰箱冷藏備用。

毒死蜱溶液、莠去津溶液、吡蟲啉溶液：直接用移液槍量取購買的原液即可。

氯化鋇溶液、硫酸鉀溶液、丙酮溶液、乙醇溶液、甲醇溶液、碳酸氫鈉溶液、氯化鋅溶液：準(zhǔn)確稱量并配制1 mol/L即可。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 AuNPs的制備

取120 mL超純水在攪拌的條件下（660 r/min）加熱至沸騰，然后依次加入7 mL 1%檸檬酸三鈉溶液和1 mL 1% HAuCl4溶液，繼續(xù)攪拌加熱20 min，顏色變化為：無色→淺紫色→紫色→紫紅色→酒紅色。停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫（25℃）。然后移入100mL棕色容量瓶，定容，得到AuNPs溶液濃度為47.8 μg/mL，放4℃冰箱備用。

1.2.2 CBZ檢測方法

用移液槍量取6.00 mmol/L AuNPs溶膠于5 mL的小試管中，加入27.00 nmol/L的多菌靈適配體混合均勻，靜置5 min后加入0～1040 nmol/L的多菌靈、5.00 mmol/L NaCl和0.25 mmol/L VBB，然后定容到2 mL，將反應(yīng)液放入比色皿中，測定1 618 cm-1處的SERS峰強(qiáng)度I，I0是不加CBZ的空白試驗(yàn)組，計算ΔI=I0-I。每個試驗(yàn)組均進(jìn)行3次平行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 體系檢測原理

用檸檬酸三鈉還原HAuCl4溶液制備出酒紅色的AuNPs為基底，以VBB為探針分子，當(dāng)體系不存在多菌靈時，AuNPs被適配體包裹，以VBB與AuNPs的基礎(chǔ)面積減少，體系在1 618 cm-1處SERS信號強(qiáng)度下降。加入多菌靈后，多菌靈與適配體特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，裸露在溶液中的AuNPs與VBB接觸面增大，體系在1 618 cm-1SERS信號強(qiáng)度上升，據(jù)此建立多菌靈的SERS檢測體系（如圖1）。

圖1 檢測原理圖Fig.1 Detection schematic diagram

2.2 透射電鏡表征高活性AuNPs

通過透射電鏡（TEM）掃描酒紅色的AuNPs溶膠（見圖2），結(jié)果（見圖3）表明所制備的AuNPs形狀是球形的，其平均直徑是20 nm。球形金納米比表面積較高、穩(wěn)定性好。

圖2 AuNPs溶膠Fig.2 AuNPs sol

圖3 AuNPs透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy of AuNPs

2.3 多菌靈-適配體-AuNPs體系SERS光譜

多菌靈-適配體-AuNPs體系SERS光譜見圖4。

圖4 多菌靈-適配體-AuNPs體系SESR光譜Fig.4 SERS spectra of CBZ-Apt-AuNPs system

當(dāng)體系沒有多菌靈時，由于AuNPs被適配體包裹，在1 618 cm-1處出現(xiàn)較弱的SERS特征峰。當(dāng)加入多菌靈后，多菌靈與適配體特異性結(jié)合成穩(wěn)定的復(fù)合物，AuNPs被釋放，與VBB接觸面增大，在1 618 cm-1處有較強(qiáng)的SERS特征峰，隨著多菌靈濃度的增加，1 618 cm-1處的SERS特征峰呈線性關(guān)系。

2.4 紫外—可見光吸收光譜

AuNPs紫外—可見光吸收光譜見圖5。

圖5 AuNPs紫外-可見光吸收光譜Fig.5 UV-Vis absorption spectrum of AuNP

由圖5a曲線可以得出AuNPs溶膠紫外吸收峰范圍在520 nm～530 nm之間，納米為球形納米，與電鏡圖相符。圖5b為多菌靈-多菌靈適配體-AuNPs體系結(jié)合的結(jié)果。加入多菌靈后，多菌靈-適配體-AuNPs復(fù)合體增加，NaCl聚集作用減弱從而減少淡藍(lán)色聚集體，體系呈紅色，故在520 nm～530 nm范圍的吸收峰增強(qiáng)，與SERS光譜一致。

2.5 共振瑞利散射（RRS）光譜

AuNPs RRS光譜見圖6。

圖6 AuNPs RRS光譜Fig.6 RRS spectrum of AuNPs

在圖6a曲線可以看到AuNPs溶膠在290、369、445、520 nm處都有RRS峰。隨著多菌靈的加入（見圖6b），多菌靈-適配體-AuNPs復(fù)合體增加，導(dǎo)致AuNPs這4個RRS峰峰值降低，與SERS光譜結(jié)果一致。

2.6 體系影響因素的優(yōu)化

不同濃度下各因素對體系的影響見圖7。

圖7 不同濃度下各因素對體系的影響Fig.7 Effects on the system of various factors at different concentrations

分別對影響體系的AuNPs、NaCl、VBB及適配體等因素進(jìn)行優(yōu)化，由試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)AuNPs、NaCl、VBB及適配體的濃度分別為 6.00、5.00、0.25、27.00 nmol/L時，體系的SERS信號最強(qiáng)，故最終選取AuNPs、NaCl、VBB及適配體的最佳濃度分別為 6.00、5.00、0.25、27.00 nmol/L以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.7 干擾物質(zhì)的影響

專一的適配體與特定靶物質(zhì)會發(fā)生特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)靶物質(zhì)的檢測。在優(yōu)化好的檢測體系中加入156 nmol/L的多菌靈后，分別加入10種常見的干擾物質(zhì)對體系進(jìn)行干擾試驗(yàn)。常見干擾物質(zhì)對體系的影響見表1。

表1 常見干擾物質(zhì)對體系的影響Table 1 Influence of common interfering substances on the system

由表1可知，1.75×105nmol/L的丙酮溶液、乙醇溶液、甲醇溶液、BaCl2溶液、K2SO2溶液、NaHCO3溶液及ZnCl2溶液不干擾測定，1.56×104nmol/L的莠去津溶液、吡蟲咪溶液、毒死蜱溶液不干擾測定，說明該法具有較高的選擇性。

2.8 工作曲線

為了研究這種用適配體包裹AuNPs從而進(jìn)行定量檢測多菌靈濃度的可行性，通過分析不同濃度下多菌靈的SERS信號強(qiáng)度變化趨勢。將反應(yīng)體系SERS信號強(qiáng)度對多菌靈濃度作圖，得到擬合曲線。反應(yīng)體系檢測多菌靈的靈敏度分析見圖8，反應(yīng)體系檢測多菌靈的工作擬合曲線見圖9。

圖8 反應(yīng)體系檢測多菌靈的靈敏度分析Fig.8 Sensitivity analysis of carbendazim in the reaction system

圖9 反應(yīng)體系檢測多菌靈的工作擬合曲線Fig.9 Work fitting curve of carbendazim detection by reaction system

如圖8所示，隨著多菌靈濃度的增加，反應(yīng)體系的SERS信號不斷增強(qiáng)，在到達(dá)一定濃度（520nmol/L）后無上升趨勢，甚至開始下降。如圖9所示，在多菌靈較低濃度下（0～520 nmol/L），SERS信號強(qiáng)度的增值與多菌靈濃度的線性擬合曲線，其線性方程為y=4.4394x+67.523，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8，最低檢出限為4.13 nmol/L，說明該法具有較好的靈敏性。

3 結(jié)論

通過利用檸檬酸三鈉的還原性可快速制備酒紅色球形金納米 AuNPs，AuNPs在NaCl作用下發(fā)生聚集，以VBB為探針分子，體系在1 618 cm-1處表現(xiàn)出較強(qiáng)的SERS特征峰。當(dāng)加入多菌靈適配體時，AuNPs被包裹，形成AuNPs適配體結(jié)合體，VBB與AuNPs接觸面減少，1 618 cm-1處的SERS特征峰信號降低。當(dāng)加入CBZ時，CBZ與適配體特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而使AuNPs被釋放，體系SERS信號增強(qiáng)。隨著CBZ濃度的增加，AuNPs被釋放得越多，體系SERS峰信號越強(qiáng)。通過優(yōu)化條件后，CBZ在6.5 nmol/L～520 nmol/L濃度范圍內(nèi)，其SERS信號強(qiáng)度變化值表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，y=4.4394x+67.523，線性范圍R2=0.998 8。建立的方法靈敏度高、選擇性好，有望運(yùn)用于果蔬中農(nóng)藥殘留的檢測。