鄒立飛，鄭鵬

（1.興義民族師范學(xué)院，貴州 興義 562400；2.云南師范大學(xué)，云南 昆明 650500；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510642）

薏苡是一種原產(chǎn)于亞洲，兼具食用和藥用價(jià)值的禾本科植物。2017年薏苡在我國貴州種植面積達(dá)到了4.67萬公頃，年產(chǎn)優(yōu)質(zhì)薏仁米約10.5萬噸，貴州薏仁米的主產(chǎn)區(qū)是貴州省黔西南州興仁市，同時(shí)興仁市也被譽(yù)為“中國薏仁米之鄉(xiāng)”[1]。薏仁米中含薏苡仁酯、神經(jīng)酰胺、維生素E、蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素、核桃酚、多酚（針葉樹醇、丁香酸、阿魏酸、丁香酚等）、黃酮類化合物（芹菜素、木犀草素、諾皮素、陳皮素、異黃酮、槲皮素等）多種生物活性成分[2]，使得薏仁米在抗氧化、抗炎癥、抗癌、抗糖尿病、抗肥胖、調(diào)節(jié)腸道微生物群等上都有一定效果[3]。MANOSROIA等[4]通過研究薏仁米提取物對(duì)5種人體癌細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)薏仁米提取物對(duì)5種癌細(xì)胞都具有抗增殖能力。CHUNG C等[5]發(fā)現(xiàn)薏仁米乙醇提取物對(duì)胃癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用，同時(shí)證實(shí)薏仁米中具有抗氧化活性的酚酸對(duì)潰瘍有緩解作用。CHOI G等[6]研究發(fā)現(xiàn)薏仁米水提取物作用于肥胖雄性小鼠可降低其脂肪積累和血清膽固醇水平，進(jìn)而控制小鼠的體重。隨著消費(fèi)者對(duì)綠色健康營養(yǎng)食品的需求，薏仁米及其相關(guān)食品越來越受到消費(fèi)者的關(guān)注。國內(nèi)薏仁米主要通過蒸煮的方式被食用，但簡單的蒸煮在一定程度上限制了薏仁米營養(yǎng)成分的吸收。通過對(duì)薏仁米進(jìn)行加工處理使其有益生物活性成分更易被人體吸收變得很有必要。釀酒作為薏仁米加工的一個(gè)重要研究方向也得到消費(fèi)者的認(rèn)可。近年來，研究者對(duì)薏仁米酒進(jìn)行了相關(guān)的研究。曹冠華等[7]通過正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)初始糖度0.2、初始pH 3、酵母量4%、薏仁∶冬瓜 1∶20（質(zhì)量比）時(shí)，薏仁米酒感官體驗(yàn)最佳。Xu L等[8]發(fā)現(xiàn)酵母發(fā)酵薏仁米后總酚量、氨基酸量顯著增加，同時(shí)增強(qiáng)了抗氧化能力、自由基清除活性。黃健等[9]通過響應(yīng)面法分析得到物料比1∶2.6（質(zhì)量比）、料液比 1∶2.9（g/mL）、接種量 2.5%、發(fā)酵時(shí)間 19 d 時(shí)，薏仁米酒香味和諧口感佳。現(xiàn)今薏仁米酒主要向保健酒方向發(fā)展，氨基酸作為酒中的主要營養(yǎng)物質(zhì)，氨基酸量在一定程度上反映了酒的營養(yǎng)價(jià)值。并且氨基酸賦予酒濃香爽口、鮮美醇和的口感，同時(shí)其含量直接影響酒的整體風(fēng)味和質(zhì)量等級(jí)[10]?？勰覐?fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）是復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）的一個(gè)種，其可分泌產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、生淀粉糖化酶、酸性蛋白酶等[11]；其中酸性蛋白酶在發(fā)酵工業(yè)中扮演著重要的角色，在酸性條件下水解蛋白質(zhì)，釋放氨基酸或肽[12]。扣囊復(fù)膜酵母與釀酒酵母混合菌種相較于釀酒酵母單菌種發(fā)酵可以提高酒中氨基酸含量，增加酒的營養(yǎng)價(jià)值[13]。本研究將扣囊復(fù)膜酵母（S.fibuligera）A1、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）XY1混合之后用于薏仁米酒的釀造。同時(shí)在條件優(yōu)化研究方面，傳統(tǒng)方法一般采用單因素試驗(yàn)，即每次試驗(yàn)只考慮一個(gè)因素，雖然單因素試驗(yàn)具有試驗(yàn)設(shè)計(jì)簡便、分析簡單等優(yōu)點(diǎn)；但大多情況下是多因素同時(shí)影響，且各因素之間往往存在交互作用，這就導(dǎo)致單因素試驗(yàn)得到的發(fā)酵條件很多情況下不為最佳發(fā)酵條件[14-15]。因此在條件優(yōu)化時(shí)，不僅要考慮各因素單獨(dú)作用的效果，同時(shí)也需要考慮各因素之間交互作用的效果。響應(yīng)面優(yōu)化可以同時(shí)考慮各因素單獨(dú)作用和因素之間的交互作用，因此得到廣泛應(yīng)用。但響應(yīng)面法主要通過多元二次模型進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)于其他類型的模型的擬合往往表現(xiàn)不佳。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）最初是由 McCulloh和Pitts于1943年提出的，靈感來自于在神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的生物學(xué)特性[16]；多層前饋（back propagation，BP）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)常用的一種，具有自學(xué)習(xí)、自適應(yīng)、非線性映射等能力，能對(duì)任意復(fù)雜的非線性關(guān)系進(jìn)行模擬[17]。

本研究將采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。薏仁米酒中氨基酸態(tài)氮為優(yōu)化指標(biāo)，薏仁米與糯米的質(zhì)量比、混合菌種的接種量、溫度、水料比為影響因素，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)薏仁米酒發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為薏仁米酒優(yōu)化尋找新的、更適合的優(yōu)化方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

扣囊復(fù)膜酵母（S.fibuligera）A1、釀酒酵母（S.cerevisiae）XY1：興義民族師范學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的菌株。

1.1.2 主要原料及試劑

薏仁米：貴州泛亞實(shí)業(yè)（集團(tuán)）有限公司；散裝糯米：市售；淀粉酶（30 000 U/g）、糖化酶（50 000 U/g）：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；酵母膏（生物試劑）、蛋白胨（生物試劑）、葡萄糖（生物試劑）、瓊脂（生物試劑）、甲醛（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、pH值自然。YPD瓊脂培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、pH值自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液制備

挑取扣囊復(fù)膜酵母（S.fibuligera）A1、釀酒酵母（S.cerevisiae）XY1接種于不同的YPD瓊脂培養(yǎng)基上，均在30℃下培養(yǎng)48 h。從YPD瓊脂培養(yǎng)基上挑取單菌落轉(zhuǎn)接于不同YPD液體培養(yǎng)基中，均在30℃下培養(yǎng)48 h，將得到含A1菌株的液體與含XY1菌株的液體等體積混合即為種子液。

1.2.2 工藝流程

1.2.3 氨基酸態(tài)氮測定

氨基酸態(tài)氮測定采用甲醛滴定法[18]。

1.3 發(fā)酵條件優(yōu)化設(shè)計(jì)

1.3.1 最陡爬坡試驗(yàn)

在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)水料比、薏仁米與糯米質(zhì)量比、溫度、接種量設(shè)計(jì)合理的步長及變化方向，最終確定氨基酸態(tài)氮響應(yīng)的最佳區(qū)間。

1.3.2 中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）試驗(yàn)

在最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，將薏仁米∶糯米=2.0∶1（質(zhì)量比）、接種量6.0%、溫度 30.0℃、水料比3.0∶1（mL/g）作為CCD的中心點(diǎn)，同時(shí)根據(jù)各因素對(duì)氨基酸態(tài)氮的影響確定各因素的其它水平，CCD試驗(yàn)各因素水平設(shè)計(jì)見表1。同時(shí)應(yīng)用Design Expert 11.0軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。

表1 CCD試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)Table 1 Experimental level of central composite design

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

1.4.1 響應(yīng)面分析

應(yīng)用Design Expert 11.0對(duì)中心組合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到一個(gè)多元二次模型。

式中：Y 為氨基酸態(tài)氮量，mg/L；i取 1～4；j取 2～4；n 取 4；Xi、Xj分別為不同因素；a0為常數(shù)項(xiàng)；aii、aij為對(duì)應(yīng)自變量系數(shù)；ε為誤差項(xiàng)。

通過對(duì)該模型進(jìn)行分析，最終得到最大氨基酸態(tài)氮含量的理論最優(yōu)發(fā)酵條件及最優(yōu)值。

1.4.2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及模型擬合流程見圖1。

圖1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及模型擬合流程Fig.1 The diagram of a typical BP neural network topology and the process of BP neural network fitting model

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種信號(hào)向前傳播、誤差逆向傳播的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是由輸入層、隱含層、輸出層構(gòu)成，層與層之間全部相互連接，而同一層間不存在互連關(guān)系（圖1a）。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法因具有易行、計(jì)算量小、簡單、并行性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在模型模擬仿真上得到廣泛的關(guān)注。其能通過不斷調(diào)整神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的閾值和權(quán)值，使BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸出值與實(shí)際值的誤差不斷減小，進(jìn)而改善其擬合效果，具體步驟流程見圖1b。

1.5 模型驗(yàn)證及比較

通過對(duì)響應(yīng)面模型、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型分析，進(jìn)而求得各自模型的理論最大氨基酸態(tài)氮及對(duì)應(yīng)的最優(yōu)發(fā)酵條件；在各模型最優(yōu)發(fā)酵條件下對(duì)比試驗(yàn)值與理論值是否一致，并計(jì)算相對(duì)誤差。同時(shí)通過比較響應(yīng)面模型、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的相關(guān)系數(shù)（R）、決定系數(shù)（R2）、均方根誤差（root mean square error，RMSE）、絕對(duì)平均相對(duì)誤差（absolute average relative error，AARE）來確定更合適的模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。通過對(duì)最陡爬坡試驗(yàn)中各處理的氨基酸態(tài)氮含量的比較分析，確定CCD試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental results and design of the steepest ascent path

由表2可知，處理1至處理3氨基酸態(tài)氮量逐漸增加，但處理3至處理5氨基酸態(tài)氮量逐漸減少，處理3條件下氨基酸態(tài)氮量最大，因此將處理3作為CCD試驗(yàn)的中心點(diǎn)。同時(shí)將響應(yīng)面優(yōu)化大致范圍確定在處理2至處理4區(qū)間。

2.2 CCD試驗(yàn)結(jié)果及響應(yīng)面分析

在最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design Expert 11.0軟件進(jìn)行CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果分析。CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。二次模型的方差分析見表4。

表3 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental results and design of the central composite design

表4 二次模型的方差分析Table 4 ANOVA for quadratic model

由表4可知，模型F值為34.37，相對(duì)應(yīng)的P值小于0.000 1，說明此模型極顯著。同時(shí)，交互項(xiàng)X1X2差異顯著，一次項(xiàng) X3、X4、交互項(xiàng) X1X3、X1X4、X3X4、二次項(xiàng)X12、X22、X32、X42差異極顯著，且模型的 R2為 0.969 77，說明該模型較準(zhǔn)確；并且模型的信噪比為21.425遠(yuǎn)大于4，說明模型預(yù)測精確。通過二次模型方差分析得到模型：Y=-4 454.172 58+48.018 81X1+600.693 36X2+230.247 67X3-10.907 16X4-42.926 03X1X2+45.558 68 X1X3-228.097 94X1X4-4.098 53X2X3+30.483 8X2X4+49.43873X3X4-122.27793X12-39.21948X22-7.291 05X32-216.127 93X42。對(duì)該模型求解最優(yōu)值可知：當(dāng)薏仁米∶糯米=2.5∶1（質(zhì)量比）、接種量為 5.7%、溫度為30.7℃、水料比為2.6∶1（mL/g）時(shí)，理論氨基酸態(tài)氮量達(dá)到842.1 mg/L。通過驗(yàn)證試驗(yàn)得到實(shí)際值為833.3 mg/L，與理論值相差不大。

響應(yīng)面模型效果圖見圖2。

圖2 響應(yīng)面模型效果圖Fig.2 The effect diagram of quadratic model

由圖2可知，在最優(yōu)條件下，其響應(yīng)面效果較好。綜上所述，通過響應(yīng)面分析得到的模型具有較好的擬合效果及預(yù)測準(zhǔn)確性。

2.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析

在Matlab 2016a環(huán)境下，通過BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)CCD試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的主要參數(shù)：輸入層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為4，隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為20，輸出層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為1，最大迭代次數(shù)為200；同時(shí)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)率為0.06。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型均方誤差效果見圖3。

圖3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型均方誤差效果圖Fig.3 The effect diagram of mean square error of BP neural network model

由圖3可知，當(dāng)?shù)螖?shù)到3次時(shí)，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的驗(yàn)證集均方誤差為0.008 271 1，且此時(shí)已經(jīng)達(dá)到訓(xùn)練結(jié)束的條件。

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬仿真效果見圖4。

圖4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬仿真效果Fig.4 The simulation effect of the BP neural network

由圖4可知，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.994 94，說明該模型擬合效果較好。通過對(duì)該模型進(jìn)行最優(yōu)值求解，發(fā)現(xiàn)在薏仁米∶糯米=2.8∶1（質(zhì)量比）、接種量為4.8%、溫度為28.2℃、水料比為2.2∶1（mL/g）時(shí)，得到該模型的最大值，即為925.3 mg/L。同時(shí)對(duì)上述條件下得到的最優(yōu)值進(jìn)行驗(yàn)證，最終得到實(shí)際值為918.7 mg/L，與理論值基本一致，說明其預(yù)測準(zhǔn)確性較好。綜上所述，說明通過BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)得到的擬合效果及預(yù)測準(zhǔn)確性均較好。

2.4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與響應(yīng)面模型比較

通過對(duì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型、響應(yīng)面模型進(jìn)行對(duì)比分析，確定較優(yōu)的模型結(jié)果見表5。

表5 優(yōu)化條件和驗(yàn)證結(jié)果Table 5 Optimization conditions and validation

由表5可知，響應(yīng)面模型、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在其各自模型最優(yōu)條件下的理論值與試驗(yàn)值的相對(duì)誤差都較小，但BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的相對(duì)誤差更小。通過對(duì)兩種模型的相關(guān)系數(shù)（R）、決定系數(shù)（R2）、均方根誤差（root mean square error，RMSE）、絕對(duì)平均相對(duì)誤差（absolute average relative error，AARE）、線性擬合等進(jìn)行分析，通過分析兩種模型的線性擬合效果及預(yù)測值與實(shí)際值的接近程度，確定在擬合效果上更優(yōu)的模型，結(jié)果見表6、圖5及圖6。

表6 響應(yīng)面法與BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測能力的比較Table 6 Comparison of predictive capacity of response surface methodology and BP neural network

圖5 響應(yīng)面模型、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測值與實(shí)際值線性擬合結(jié)果Fig.5 Linear fitting for predicted values（response surface methodology model and BP neural network model）with experimental values

圖6 響應(yīng)面模型、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測值與實(shí)際值比較結(jié)果Fig.6 Comparison of predicted values（response surface methodology model and BP neural network model）with experimental values

試驗(yàn)結(jié)果顯示BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型相較于響應(yīng)面模型的擬合效果更優(yōu)。綜上說明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在本研究中擬合能力和優(yōu)化能力更好。

ALRUGAIBAH M等[19]研究發(fā)現(xiàn)通過BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化蔓越莓果渣花青素的提取條件相較于響應(yīng)面優(yōu)化的準(zhǔn)確度和精確度都更好。CHOUAIBI M等[20]通過研究響應(yīng)面法和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)瓜蔞籽油產(chǎn)油率進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果顯示BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型、響應(yīng)面模型的決定系數(shù)（R2）、均方根誤差（RMSE）分別為 0.998、0.278 4和0.976 9、0.534 9，說明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)比響應(yīng)面具有更好的預(yù)測能力。GARG A等[21]采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和響應(yīng)面法優(yōu)化海藻油生物柴油生產(chǎn)工藝，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、響應(yīng)面法決定系數(shù)分別為0.99、0.96，說明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有良好的可預(yù)測性。胡欣穎等[22]通過對(duì)比響應(yīng)面法和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在優(yōu)化松板肉工藝，試驗(yàn)結(jié)果表明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化后的成品率更好，誤差更小，擬合效果更好。

本研究也表明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在預(yù)測準(zhǔn)確性、擬合效果上都要優(yōu)于響應(yīng)面法。綜上所述，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化效果均好于響應(yīng)面法，這可能是因?yàn)锽P神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以通過誤差逆向傳播，使誤差不斷減小，進(jìn)而預(yù)測值無限逼近真值，最終提高模型的擬合效果和預(yù)測能力[23-25]。本研究只針對(duì)氨基酸態(tài)氮量進(jìn)行研究，但具體薏仁米酒中氨基酸的種類、各種氨基酸的含量及薏仁米酒中的其他有益物質(zhì)含量有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)比響應(yīng)面、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在薏仁米酒中氨基酸態(tài)氮量的優(yōu)化效果，最終發(fā)現(xiàn)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在擬合效果和預(yù)測準(zhǔn)確性上都優(yōu)于響應(yīng)面模型。響應(yīng)面優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件：薏仁米∶糯米=2.5∶1（質(zhì)量比）、接種量為5.7%、溫度為30.7℃、水料比為2.6∶1（mL/g），此時(shí)氨基酸態(tài)氮的理論值為 842.1 mg/L，實(shí)際值為833.3 mg/L，預(yù)測值與實(shí)際值的相對(duì)誤差為1.0%；BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件：薏仁米∶糯米=2.8∶1（質(zhì)量比）、接種量為4.8%、溫度為28.2℃、水料比為2.2∶1（mL/g），此時(shí)氨基酸態(tài)氮的理論值為925.3 mg/L，實(shí)際值為918.7 mg/L，預(yù)測值與實(shí)際值的相對(duì)誤差為0.7%。響應(yīng)面模型、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的相關(guān)系數(shù)（R）、決定系數(shù)（R2）、均方根誤差（RMSE）、絕對(duì)平均相對(duì)誤差（AARE）分別為 0.984 77、0.969 77、22.759 38、0.031 15 和 0.994 94、0.989 91、13.206 39、0.008 84。綜上所述，在本研究中BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在預(yù)測準(zhǔn)確性、擬合效果上都優(yōu)于響應(yīng)面，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)薏仁米酒氨基酸態(tài)氮優(yōu)化效果更好。