程鈺迪，程敏，2*，王銳，鄭國慶，梁旭華

（1.商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，陜西 商洛 726000）

梔子（Gardenia jasminoides Ellis）屬茜草科梔子屬植物，又名黃梔子、山梔、白蟾，是我國應(yīng)用廣泛的中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。梔子果是由新鮮成熟的梔子果實(shí)經(jīng)干燥處理后所得的產(chǎn)物，梔子果中富含藏紅花素類、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、有機(jī)脂肪酸類等多種化學(xué)成分，具有良好的抗氧化[1]、抗炎鎮(zhèn)痛[2-3]、抗微生物[4]、抗血栓[5]、消腫護(hù)肝[6]等功效。梔子中提取出的梔子色素作為天然色素，被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中[7]。1998年衛(wèi)生部公布梔子果為藥食兩用資源后，梔子在食品中的應(yīng)用逐漸引起人們的重視。梔子苷是鑒別和評(píng)價(jià)梔子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)，在保肝利膽[8]、抗抑郁[9]、解熱鎮(zhèn)痛和保護(hù)心血管內(nèi)皮細(xì)胞等方面具有一定功效。目前國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)梔子的化學(xué)成分與藥理藥效方面研究較多，但將其作為保健食品以及在食品工業(yè)中的應(yīng)用還不多見。

市面上常見的果凍，外觀晶瑩，色彩鮮亮，口感柔滑細(xì)膩，深受消費(fèi)者的喜愛。但隨著人們對(duì)健康生活的關(guān)注，具有高營養(yǎng)價(jià)值和一定保健功能的果凍可能是未來的發(fā)展方向[10]。梁曉娟等[11-13]通過使用百合、柿子和芹菜以及其它藥食兩用食品，對(duì)果凍的營養(yǎng)保健功效進(jìn)行了研究。目前尚無關(guān)于以梔子苷為主要成分的果凍的研究報(bào)道。本研究針對(duì)梔子苷的提取工藝和梔子苷保健果凍制備工藝進(jìn)行雙優(yōu)化，旨在開發(fā)出一款色澤誘人、口感光滑細(xì)膩且具有一定清熱利膽功效的梔子苷保健果凍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子苷對(duì)照品（批號(hào)AF9032906，純度≥98%）：成都埃法生物科技有限公司；梔子果實(shí)：市售，產(chǎn)自河南洛陽；乙腈（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；乙酸乙酯（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉、木糖醇：市售；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀：日本島津（中國）有限公司；S-114電子分析天平：上海梅穎浦儀器有限公司；800Y-304粉碎機(jī)：鉑歐五金制品有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海力辰邦西儀器科技有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：長沙明杰儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 梔子果實(shí)的預(yù)處理

梔子果實(shí)經(jīng)干燥粉碎后得到梔子粉末，過40目篩，備用。

1.3.2.2 梔子苷提取

取適量的梔子粉末與乙酸乙酯混合置于圓底燒瓶中，回流提取數(shù)小時(shí)后過濾，冷卻至10℃～30℃，得到梔子苷提取液[14]。

1.3.2.3 調(diào)配

以一定的料液比，將瓊脂粉加入水中，用小火煮膠，加熱使其完全溶解，過程中需不斷攪拌，再加入適量的木糖醇和梔子苷提取液，攪拌均勻。

1.3.2.4 罐裝殺菌

趁熱將混合好的果凍液倒進(jìn)模具中，80℃～85℃條件下水浴加熱，持續(xù)15 min后冷卻至10℃～30℃，即得梔子苷保健果凍。

1.3.3 感官評(píng)價(jià)

由10名（5男5女）食品專業(yè)同學(xué)組成的評(píng)價(jià)小組，對(duì)試驗(yàn)制備的果凍進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，主要從梔子苷保健果凍的外觀色澤、風(fēng)味、口感和組織形態(tài)等多方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表1[15]。

表1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory assessment standard

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 梔子苷提取工藝的單因素試驗(yàn)

選取提取時(shí)間、提取溫度及梔子粉末與乙酸乙酯的料液比3個(gè)因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以梔子苷提取率為指標(biāo)，確定適宜的單因素水平。

1.4.2 梔子苷提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取時(shí)間、提取溫度、梔子粉末與乙酸乙酯的料液比3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以梔子苷提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)二次多項(xiàng)方程進(jìn)行顯著性分析，優(yōu)化梔子苷提取工藝參數(shù)。響應(yīng)曲面的試驗(yàn)因素和水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

1.4.3 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定梔子苷的含量

色譜條件[16]：色譜柱ShimadzuC18（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水體積比 15∶85；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：238 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取2.03 mg梔子苷對(duì)照品于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解定容，即得濃度為0.2 mg/mL的梔子苷對(duì)照品溶液。

樣品溶液的制備：取1 mL優(yōu)化后最佳工藝所得的梔子苷提取液于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解定容，通過0.45 μm微孔濾膜后上機(jī)分析。

用50%甲醇將濃度為0.2 mg/mL的梔子苷對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，得到濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL的溶液。在上述色譜條件下進(jìn)行測定，得到一元線性回歸方程：Y=13 339X-10 393，R2=0.999 8，式中：Y為峰面積；X為梔子苷對(duì)照品濃度，μg/mL。回歸方程顯示在20.00 μg/mL～160.00 μg/mL的濃度范圍內(nèi)相關(guān)性良好。

1.4.4 果凍制備工藝的單因素試驗(yàn)

選取瓊脂粉與水的料液比、梔子苷提取液添加量及木糖醇添加量3個(gè)因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以果凍感官評(píng)分為指標(biāo)，確定適宜的因素水平。

1.4.5 果凍制備工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取瓊脂粉與水的料液比、梔子苷提取液添加量、木糖醇添加量3個(gè)因素為自變量，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型優(yōu)化果凍制備工藝條件。響應(yīng)曲面試驗(yàn)因素和水平見表3。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平Table 3 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

1.5 數(shù)據(jù)處理

在數(shù)據(jù)分析過程中，采用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子苷提取工藝的單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 提取時(shí)間、提取溫度、料液比對(duì)梔子苷提取率的影響Fig.1 Effects of extraction time，extraction temperature and material-liquid ratio on extraction rate of geniposide

由圖1可知，當(dāng)提取時(shí)間小于3 h時(shí)，提取率不斷升高并在3 h達(dá)到最大值5.47%，當(dāng)提取時(shí)間大于3 h時(shí)，可能由于梔子粉末中的雜質(zhì)在長時(shí)間高溫回流下不斷被溶出，影響提取效果，提取率整體降低。因此，提取時(shí)間選擇3 h為宜。

提取溫度55℃～75℃時(shí)，提取率不斷增大，75℃時(shí)提取率最高達(dá)到4.65%，繼續(xù)升高溫度，提取率降低。可能由于梔子粉末與乙酸乙酯回流溫度過高，原料中的梔子苷被破壞，影響了提取效果。因此，提取溫度選擇75℃為宜。

料液比為 1∶2（g/mL）～1∶5（g/mL）時(shí)，梔子苷提取率隨溶劑體積增大不斷提高，1∶5（g/mL）時(shí)提取率最高達(dá)到4.91%，若繼續(xù)增加乙酸乙酯的體積，梔子苷提取率呈下降趨勢，可能是由于梔子粉末與乙酸乙酯的混合溶液含有其它雜質(zhì)成分，溶劑體積升高使得雜質(zhì)溶出，反而不利于梔子苷的提取。因此，料液比選擇1 ∶5（g/mL）為宜。

2.2 梔子苷提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗(yàn)

三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

續(xù)表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Continue table 4 Experimental design and results for response surface analysis

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表4的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=5.80+0.099A+0.15B+0.19C-0.085AB+0.12AC-0.20BC-0.63A2-0.54B2-0.35C2。

為了更好地驗(yàn)證方程的有效性，對(duì)得出的梔子苷提取率的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行了方差分析，結(jié)果如表5所示。

表5 梔子苷提取率的方差分析Table 5 Analysis of variance of geniposide extraction rate

根據(jù)表5分析可知，模型的P<0.000 1極顯著[17]。模型的失擬項(xiàng)P>0.05，不顯著，表明擬合的回歸方程符合實(shí)際情況，該模型可行性高，誤差小，可用此模型對(duì)梔子苷的提取工藝參數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測[18]。由顯著性檢驗(yàn)分析得出，模型中 B、C 及 BC、A2、B2、C2均有極顯著的影響。一次項(xiàng)A對(duì)響應(yīng)值有顯著影響。在所選取的水平因素范圍內(nèi)，由F值的大小，可得出影響梔子苷提取率強(qiáng)弱的順序依次為C>B>A，即梔子粉末與乙酸乙酯料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間。

該模型的R2=0.982 3，R2Adj=0.959 6，表明該模型與實(shí)際情況擬合度較好，模型可行性好，試驗(yàn)誤差小[19]。變異系數(shù)CV=2.13%，說明模型預(yù)測效果好，能較好地反映真實(shí)試驗(yàn)值，即梔子苷的最佳提取工藝可通過該方程來確定[20]。

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖傾斜程度越大，表明響應(yīng)值對(duì)因素的變化越敏感。反之，表明響應(yīng)值對(duì)因素的變化不敏感，結(jié)果見圖2。

圖2 各因素的交互作用對(duì)梔子苷提取率的影響Fig.2 Effect of interaction of various factors on extraction rate of Geniposide

由響應(yīng)面圖可知提取時(shí)間、提取溫度、料液比與梔子苷提取率存在相關(guān)性。采用Design-Expert 8.0.6軟件分析，獲得了梔子苷的最佳提取工藝為：提取時(shí)間3.10 h，提取溫度75.41℃，梔子粉末與乙酸乙酯的料液比1∶5.26（g/mL），預(yù)測梔子苷的提取率可達(dá)到5.84%。根據(jù)實(shí)際操作的可行性，最佳配方修正為：提取時(shí)間3.00 h，提取溫度75.00℃，梔子粉末與乙酸乙酯的料液比1∶5.00（g/mL），為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，采用以上工藝，重復(fù)試驗(yàn)3次，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，此條件下測得的梔子苷提取率為5.81%，與預(yù)測值接近度為99.49%，表明該模型能很好地反映梔子苷的提取率與各影響因素之間的關(guān)系。

2.3 果凍制備工藝的單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 料液比、梔子苷提取液添加量、木糖醇添加量對(duì)果凍品質(zhì)的影響Fig.3 Effects of material-liquid ratio，geniposide extract and xylitol on the quality of jelly

由圖3可見，感官評(píng)分隨溶劑體積增大先升高后降低，若瓊脂粉的添加量過少，果凍無法凝固、咀嚼口感不佳。當(dāng)瓊脂粉與水的料液比達(dá)到1∶50（g/mL）時(shí)，果凍的硬度、彈性及咀嚼性達(dá)到最佳狀態(tài)。若瓊脂粉的添加量過高，果凍質(zhì)地過硬、失去彈性。因此，下一步試驗(yàn)中料液比選定為1∶50（g/mL）。

感官評(píng)分先隨梔子苷提取液添加量的增加而增大，呈明顯上升趨勢，梔子苷提取液添加量5%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值，之后下降趨勢明顯。梔子苷提取液添加量過少，易導(dǎo)致梔子風(fēng)味不明顯；添加過多，易導(dǎo)致產(chǎn)品口感過酸。因此，下一步試驗(yàn)中梔子苷提取液添加量選定為5%。

當(dāng)木糖醇的添加量低于8%時(shí)，口感略酸。當(dāng)添加8%的木糖醇時(shí)，口感適宜，能凸顯梔子果凍的獨(dú)特風(fēng)味。高于8%時(shí)，又過于甜膩。因此，下一步試驗(yàn)中木糖醇添加量選定為8%。

2.4 果凍制備工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 回歸模型的建立與檢驗(yàn)

選取瓊脂粉與水的料液比、梔子苷提取液添加量、木糖醇添加量為自變量，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)梔子苷保健果凍制備工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 6 Experimental design and results for response surface analysis

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表6數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=89.40+4.50A+2.63B-4.88C-0.75AB+2.25AC-1.50BC-8.45A2-6.20B2-9.70C2。

梔子苷果凍制備工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方差分析結(jié)果如表7所示。

表7 梔子苷保健果凍感官研究結(jié)果的方差分析Table 7 Analysis of variance of sensory study results of geniposide health jelly

根據(jù)表7分析可知，模型的P<0.000 1，表明此模型極其顯著，失擬項(xiàng)P>0.05，表現(xiàn)為不顯著，因此模型成立，可用此模型對(duì)梔子苷果凍的制備工藝參數(shù)做出分析和預(yù)測。由顯著性檢驗(yàn)分析得出，模型中一次項(xiàng)A、B、C 及二次項(xiàng) A2、B2、C2對(duì)果凍感官評(píng)分有極顯著的影響。交互項(xiàng)AC有顯著影響。在所選取的水平因素范圍內(nèi)，由F值的大小，可得出影響果凍感官評(píng)分強(qiáng)弱的順序依次為C>A>B，即木糖醇添加量＞料液比＞梔子苷提取液添加量。

模型的回歸系數(shù)為R2=0.989 4，校正回歸系數(shù)為R2Adj=0.975 7，表明該回歸模型擬合度較好，試驗(yàn)誤差小，只有2.43%左右的變異不能用此模型進(jìn)行分析。變異系數(shù)CV=1.88%，表示這個(gè)模型能反映各因素與果凍感官評(píng)分之間真實(shí)關(guān)系，即梔子苷保健果凍的最佳制備工藝可通過該方程來確定。

2.4.2 響應(yīng)面圖分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面分析圖，見圖4。

圖4 各因素的交互作用對(duì)果凍感官評(píng)分的影響Fig.4 Effects of interaction of various factors on sensory score of jelly

由響應(yīng)面圖可知在優(yōu)化梔子苷保健果凍制備工藝配方的過程中，料液比、梔子苷提取液添加量、木糖醇添加量與感官評(píng)分存在相關(guān)性。采用Design-Expert 8.0.6軟件分析，獲得了梔子苷保健果凍的最佳制備工藝配方為：瓊脂粉與水的料液比 1∶52.24（g/mL），梔子苷提取液添加量5.23%，木糖醇添加量7.76%，預(yù)測梔子苷保健果凍的感官評(píng)分可達(dá)到90.79分。根據(jù)實(shí)際操作的可行性，最佳配方修正為：瓊脂粉與水的料液比 1∶52.00（g/mL），梔子苷提取液添加量 5.00%，木糖醇添加量8.00%，為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，采用以上工藝配方，重復(fù)試驗(yàn)3次，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，此條件下制作的梔子苷保健果凍的感官評(píng)分為90.00分，與預(yù)測值接近度為99.13%，表明該模型能很好地反映梔子苷保健果凍的感官評(píng)分與各影響因素之間的關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面法，針對(duì)梔子苷的提取工藝和梔子苷保健果凍制備工藝進(jìn)行雙優(yōu)化，得到梔子苷提取率3個(gè)影響因素的主次關(guān)系為：梔子粉末與乙酸乙酯的料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間，梔子苷最佳提取工藝的條件為：提取時(shí)間3.00 h，提取溫度75.00℃，梔子粉末與乙酸乙酯的料液比1∶5.00（g/mL），該工藝條件下，梔子苷提取率可達(dá)到5.81%。得出梔子苷保健果凍的最佳制備工藝條件為：瓊脂粉與水的料液比1∶52.00（g/mL），梔子苷提取液添加量 5.00%，木糖醇添加量8.00%，該條件下梔子苷保健果凍的感官評(píng)分可達(dá)到90.00分。