劉 凱，趙星哲，王紅霞，趙書崗，張俊佩，馬慶國(guó)，張志華

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071001; 3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；4.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所/國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091）

核桃是世界范圍內(nèi)占有重要地位的經(jīng)濟(jì)類果樹之一，高溫、低溫、重金屬等非生物環(huán)境因素會(huì)嚴(yán)重影響其正常生長(zhǎng)發(fā)育，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。晚霜易造成核桃的花芽、嫩梢、花器和幼果受凍，影響產(chǎn)量，嚴(yán)重時(shí)可使核桃絕收，造成大小年現(xiàn)象。而我國(guó)北方地區(qū)，春季周期性寒流是不可避免的。因此，如何防治核桃冷害已成為生產(chǎn)上亟待解決的問題［2］。

GRAS家族是一類僅存在于植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，由最初發(fā)現(xiàn)的3個(gè)家族成員GAI(gibberellic acid insensitive)、RGA (repressor of GA1-3 mutant)、SCR (scarecrow)的特征字母命名［3］，一般由 400～800 個(gè)氨基酸殘基組成，該蛋白的C端是高度保守的［4］，分成8個(gè)分支，分別為：SCL3、SHR、PAT1、LISCL、DELLA、SCR、LS和HAM［5］。目前已在桃［6］、鐵皮石斛［7］、甜橙［8］、辣椒［9］等多種植物中發(fā)現(xiàn)GRAS轉(zhuǎn)錄因子。GRAS家族蛋白在赤霉素(GA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［10］、腋芽及根的發(fā)育、光信號(hào)通路、結(jié)瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及在逆境脅迫中發(fā)揮作用［11］，多項(xiàng)研究表明GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族成員廣泛參與到植物響應(yīng)非生物脅迫過程中［12-13］，特別是調(diào)節(jié)植物抗寒性［14-15］。李麗麗等［16］研究發(fā)現(xiàn)，GRAS轉(zhuǎn)錄因子LaSCL18基因表達(dá)與獨(dú)行菜幼苗耐受低溫有關(guān)；袁陽陽等［17］以山葡萄為試材，證實(shí)了GRAS轉(zhuǎn)錄因子VaPAT1在調(diào)節(jié)植物抗逆的過程中特別是低溫過程起正向調(diào)控作用。然而在核桃中GRAS家族成員和核桃抗寒性之間的關(guān)系報(bào)道較少。本研究通過生物信息學(xué)在核桃基因組中挖掘GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族成員，并分析該家族成員理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、進(jìn)化關(guān)系、啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)及蛋白功能互作，解析核桃GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，研究將為逆境應(yīng)答過程中GRAS轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與核桃抗逆分子遺傳改良以及分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料核桃(Juglans regiaL.)種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園，盆栽，同一砧木嫁接‘遼寧8號(hào)’（耐低溫）和‘清香’（不耐低溫），2年生苗。用于后續(xù)研究的試驗(yàn)材料分為正常組(冷處理0 h)和0.5 ℃冷處理48 h。采集第1片復(fù)葉中自單葉起左數(shù)第2葉片送至北京諾禾致源科技股份有限公司用于RNA-Seq測(cè)序，3株混合后為1次，共3次重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核桃JrGRAS基因家族分析 根據(jù)TAIR（https://www.arabidopsis.org/）擬 南 芥JrGRAS家族蛋白序列信息應(yīng)用HMMER 3.1b軟件構(gòu)建隱馬爾科夫模型，并于NCBI搜索下載核桃蛋白序列（www.ncbi.nlm.nih. gov/genome/?term=txid51240［orgn］，GCF_001411555.1），并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)家族成員進(jìn)行鑒定。利用歐洲生物信息學(xué)研究所的PFAM蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域，利用在線分析工具Gene Structure Display Server和MEME（http://meme-suite.org/）對(duì)核桃JrGRAS家族基因進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析。利用MEGA7.0軟件中的生物進(jìn)化距離法（Neighbour-Joining, NJ）構(gòu)建JrGRAS和AtGRASs家族系統(tǒng)發(fā)生樹，Bootstrap值為1 000。

1.2.2 核桃JrGRAS基因的生物信息學(xué)分析 利用NCBI上的ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffnder/)查找JrGRAS基因家族成員的ORF。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)使用ExPASy (https://web.expasy.org/protparam/)在線網(wǎng)站分析；利用NetPhos 3.1 Server和Net NGlyc 1.0 Server分別預(yù)測(cè)蛋白的糖基化和磷酸化位點(diǎn)；利用 SignalP 3.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在線工具對(duì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)；TMHMM 法分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)：基于 HMM 方法（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）的蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)工具；利用ngLOC與Nuc-PLoc在線軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；利用STRING在線分析蛋白互作；利用Plantcare在線工具分析基因家族成員啟動(dòng)子序列功能。

1.2.3 核桃JrGRAS基因家族轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析 利用轉(zhuǎn)錄組分析低溫脅迫48 h后‘遼寧8號(hào)’（耐低溫）和‘清香’（不耐低溫）轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，以FPKM 為基因表達(dá)量衡量標(biāo)準(zhǔn)，以 padj ＜0.05 和log2(golden change ＞0)為篩選差異表達(dá)閾值，篩選差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃基因組GRAS家族成員鑒定及分析

2.1.1 核桃基因組GRAS家族成員基本信息及理化性質(zhì)分析 利用擬南芥GRASs家族蛋白序列構(gòu)建隱馬爾科夫模型，結(jié)合RNA-seq分析，初步篩選出79個(gè)核桃JrGRASs家族基因。利用Pfam結(jié)構(gòu)域分析，去除冗余后最終獲得62個(gè)核桃GRASs家族基因（表1），編碼63條蛋白質(zhì)序列，根據(jù)分子量大小對(duì)其命名。該家族成員中基因長(zhǎng)度最短的為1 371 bp（JrGRAS11），最長(zhǎng)為5 713 bp（JrGRAS32）；開放閱讀框長(zhǎng)度在1 263～ 2 472 bp；翻譯得到的JrGRASs蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度處于420 ～ 823個(gè)氨基酸之間；等電點(diǎn)在4.77～8.40之間，有97 %核桃JrGRASs家族成員為偏酸性蛋白。

表1 核桃JrGRAS家族成員的基因信息Table 1 Basic information of JrGRAS family genes from walnut

續(xù)表：

利用ExPasy對(duì)基因的蛋白大?。╧Da）、穩(wěn)定系數(shù)等、疏水性、等蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)（表2），JrGRASs的分子量在46.92～89.97 kD之間；JrGRASs蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)介于34.43～61.97之間，僅有17%為穩(wěn)定蛋白，其余蛋白均為不穩(wěn)定蛋白；JrGRASs蛋白的平均疏水性介于-0.626～-0.058之間，其家族蛋白均為親水蛋白；利用 SignalP 3.0 Server在線工具和TMHMM法分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽預(yù)測(cè)和跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示核桃JrGRASs家族除JrGRAS3、JrGRAS11、JrGRAS16、JrGRAS29、JrGRAS39、JrGRAS50和JrGRAS60外其余各成員無跨膜結(jié)構(gòu)，除JrGRAS12外其余各成員無信號(hào)肽分泌蛋白；利用ngLOC和Nuc-PLoc在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，JrGRASs蛋白均定位于細(xì)胞核。

利 用Net NGlyc 1.0和NetPhos 3.1 Server預(yù) 測(cè)家族成員蛋白的磷酸化位點(diǎn)和糖基化，分析核桃JrGRASs家族成員在蛋白翻譯后修飾的差異有助于后續(xù)對(duì)蛋白功能的研究。磷酸化位點(diǎn)結(jié)果顯示JrGRASs家族蛋白均含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)(表2)，主要體現(xiàn)在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)數(shù)量的差異。其中，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)在9～70個(gè)之間；蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)在3～24個(gè)之間；僅JrGRAS5和JrGRAS41不含有絡(luò)氨酸磷酸化位點(diǎn)，其余蛋白含酪氨酸磷酸化位點(diǎn)在1～12個(gè)之間。通過對(duì)核桃JrGRASs家族成員N-糖基化和 O-糖化的潛在位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，除JrGRAS6、JrGRAS23、JrGRAS30和JrGRAS35外，其余JrGRASs蛋白的N-糖基化潛在位點(diǎn)數(shù)量在1～12個(gè)之間；另外核桃JrGRASs蛋白含有3～92個(gè)O-糖基化潛在位點(diǎn)。

表2 核桃JrGRAS家族蛋白的理化性質(zhì)Table 2 Basic information of JrGRAS family genes in walnut

續(xù)表：

2.1.2 核桃基因組GRAS家族成員保守結(jié)構(gòu)域分析 利用NCBI在線分析軟件比對(duì)核桃GRAS家族成員的蛋白序列并分析其保守結(jié)構(gòu)域(圖1)，看出核桃 63個(gè)家族成員含有典型的LAR1、LAR2、VHIID、PFYRE和SAM 5個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，特別是VHIID區(qū)域高度保守，可以看出符合GRAS家族類型特點(diǎn)。

2.2 不同物種GRAS家族進(jìn)化樹分析

本研究對(duì)核桃（63個(gè)）、擬南芥（33個(gè)）GRAS 家族蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核桃與擬南芥GRAS家族基因有一定的同源性。根據(jù)擬南芥分類將核桃分為9個(gè)亞族，HAM亞族最多，有17個(gè)成員，在LS亞組最少，只有1個(gè)。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，在核桃中出現(xiàn)了一個(gè)新的亞族NEW CLASS，具體功能有待進(jìn)一步研究。

2.3 核桃基因組GRAS家族基因結(jié)構(gòu)與蛋白域保守結(jié)構(gòu)域

為進(jìn)一步研究核桃GRAS基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化，首先對(duì)其外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（圖3）。分析表明，除JrGRAS21、JrGRAS47、JrGRAS62、JrGRAS63，該GRAS家族成員均不含內(nèi)含子，相同亞組中具有相似的基因結(jié)構(gòu)。隨后，利用 MEME 軟件對(duì)這些蛋白序列和結(jié)構(gòu)的保守性進(jìn)行了分析（圖4）。根據(jù)其保守基序分布，在核桃GRAS家族的63個(gè)成員間發(fā)現(xiàn)共同的保守基序，而且不同亞家族內(nèi)的保守基序分布具有極高的相似度；但HAM亞家族中較其他亞族成員相比，缺少相應(yīng)的保守基序，即motif 4。

圖 2 核桃和擬南芥GRAS 家族基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of JrGRAS family genes of Juglans regia and Arabidopsis thaliana

圖 3 核桃JrGRAS家族基因結(jié)構(gòu)Fig. 3 Gene structure analysis of JrGRAS family from Juglans regia

2.4 核桃GRAS家族基因啟動(dòng)子元件分析

利用Plantcare在線分析軟件預(yù)測(cè)核桃GRAS基因啟動(dòng)子區(qū)與抗逆和激素相關(guān)元件的分布，結(jié)合基因結(jié)構(gòu)分析，除無N端基因外，其他基因啟動(dòng)子區(qū)分析結(jié)果如圖5所示，核桃GRAS基因啟動(dòng)子區(qū)存在豐富的激素信號(hào)和脅迫應(yīng)答調(diào)控元件，較多成員含有光響應(yīng)元件，可能與參與核桃響應(yīng)非生物脅迫相關(guān)。

圖 4 核桃JrGRAS家族蛋白保守基序分析Fig.4 Conserved motif analysis of JrGRAS family from Juglans regia

圖 5 核桃GRAS啟動(dòng)子區(qū)與抗逆和激素相關(guān)元件分布Fig.5 Distribution of stress-related and hormone-related elements in the promoter region of JrGRAS genes

2.5 核桃GRAS家族蛋白互作預(yù)測(cè)

利用 STRING 分析該蛋白序列的互作蛋白(表3)，以擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)為參照，發(fā)現(xiàn)該家族成員中的差異表達(dá)基因與擬南芥SCR、SCL3、SHR、AT3G13840、PAT、RGL2、AT1G63100、LAS和SCL14同源關(guān)系較近，分析結(jié)果表明家族成員蛋白成員之間及與其他響應(yīng)非生物脅迫蛋白和激素相關(guān)蛋白之間均可以發(fā)生互作，例如，JrGRAS8蛋白可以與GRAS家族成員HAM互作，JrGRAS14蛋白可以與GRAS家族成員赤霉素相關(guān)蛋白GAI蛋白互作；JrGRAS20蛋白與乙烯反應(yīng)蛋白PLT1互作；JrGRAS39蛋白可以與生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BIG蛋白互作；JrGRAS53蛋白與乙烯反應(yīng)蛋白PLT1互作；JrGRAS41蛋白與介導(dǎo)CBF低溫應(yīng)激途徑蛋白R(shí)GL2互作。通過對(duì)核桃GRAS家族蛋白互作預(yù)測(cè)有助于進(jìn)一步解析GRAS家族成員作用機(jī)制。

表3 核桃GRAS家族蛋白互作信息Table 3 Protein interaction information of JrGRASs

續(xù)表：

2.6 核桃GRAS家族成員轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

利用轉(zhuǎn)錄組分析低溫脅迫48 h后‘遼寧8號(hào)’（耐低溫）和‘清香’（不耐低溫）轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，以 FPKM 為基因表達(dá)量衡量標(biāo)準(zhǔn)，核桃GRAS家族基因成員均出現(xiàn)了不同程度的變化（圖6、7）。以 padj ＜0.05 and log2(golden change ＞0)為篩選差異表達(dá)閾值，發(fā)現(xiàn)在‘遼寧8號(hào)’中JrGRAS14、JrGRAS15、JrGRAS20、JrGRAS33、JrGRAS39、JrGRAS41、JrGRAS48、JrGRAS49、JrGRAS51、JrGRAS59和JrGRAS63為差異表達(dá)基因，而在‘清香’中為JrGRAS8、JrGRAS14、JrGRAS20、JrGRAS33、JrGRAS41、JrGRAS51、JrGRAS53和JrGRAS56。在‘遼寧 8 號(hào)’中，除JrGRAS14、JrGRAS15、JrGRAS59和JrGRAS63呈下降表達(dá)趨勢(shì)外，其他7個(gè)基因成員呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；在‘清香’中，除JrGRAS8、JrGRAS14、JrGRAS53和JrGRAS56呈下降表達(dá)趨勢(shì)外，其他4個(gè)基因成員在低溫條件下都增大了表達(dá)量。在‘遼寧8號(hào)’（耐低溫）品種與‘清香’（不耐低溫）品種共同差異表達(dá)基因?yàn)镴rGRAS14、JrGRAS20、JrGRAS33、JrGRAS41、JrGRAS51和JrGRAS63，但 是 在‘遼 寧8號(hào)’（耐低溫）品種特異性差異表達(dá)為JrGRAS15、JrGRAS39、JrGRAS48、JrGRAS49、JrGRAS59，在‘遼寧8號(hào)’（耐低溫）品種特異性差異表達(dá)為JrGRAS53和JrGRAS56。本結(jié)果更有助于進(jìn)一步為GRAS轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫中的調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

圖 6 低溫脅迫48h后‘遼寧 8 號(hào)’DEGs轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析Fig.6 Transcriptional expression analysis of DEGs in‘Liaoning 8’after 48 hours of low temperature stress

圖 7 低溫脅迫48h后‘清香’DEGs轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析Fig.7 Transcriptional expression analysis of DEGs in‘Qingxiang’ after 48 hours of low temperature stress

3 討論與結(jié)論

GRAS是在植物中參與生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫重要的轉(zhuǎn)錄因子，而且在植物中廣泛分布。目前在多種植物中已經(jīng)鑒定出GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族，桃48個(gè)［6］，甜橙47個(gè)［7］，葡萄91個(gè)［18］，黃瓜37個(gè)［19］等。本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)與生物信息學(xué)結(jié)合鑒定出63個(gè)GRAS成員，由62條基因編碼63個(gè)蛋白。GRAS結(jié)構(gòu)域通常包含5個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，2個(gè)亮氨酸七肽重復(fù)基序（LRI和LRII）位于以最突出的殘基命名的VHIID基序的側(cè)面，LR基序和VHIID基序?qū)τ诘鞍踪|(zhì)或DNA相互起重要作用［20］。利用NCBI在線分析軟件比對(duì)核桃GRAS家族成員的蛋白序列并分析其保守結(jié)構(gòu)域看出核桃63個(gè)家族成員含有典型 的LAR1、LAR2、VHIID、PFYRE和SAM 5個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，可以看出符合GRAS家族類型特點(diǎn)，而且與桃［6］和擬南芥［21］中研究一致，也含有5個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域。

本研究將核桃和擬南芥GRAS家族蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，根據(jù)擬南芥分類將核桃分為9個(gè)亞族，根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，在核桃中出現(xiàn)了一個(gè)新的亞族NEW CLASS，共7個(gè)家族成員，不屬于已知的8個(gè)亞族，在桃［6］中也出現(xiàn)了區(qū)別于其他8個(gè)亞族的U族類似的現(xiàn)象，具體功能有待進(jìn)一步研究。進(jìn)行啟動(dòng)子功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)核桃GRAS基因啟動(dòng)子區(qū)存在豐富的激素信號(hào)和脅迫應(yīng)答調(diào)控元件［21-22］，且較多成員含有光響應(yīng)元件，進(jìn)一步證明了可能與參與核桃響應(yīng)非生物脅迫。利用 STRING 分析該蛋白序列的互作蛋白，以擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)為參照，發(fā)現(xiàn)該家族成員中的差異表達(dá)基因與擬南芥SCR、SCL3、SHR、AT3G13840、PAT、RGL2、AT1G63100、LAS和SCL14同源關(guān)系較近，分析結(jié)果表明家族成員蛋白與其他蛋白之間均可以發(fā)生互作，而且有研究表明 GRAS家族成員蛋白與響應(yīng)非生物脅迫相關(guān)，尤其在低溫［23］、干旱［15］、鹽［24］等。通過對(duì)核桃GRAS家族蛋白互作預(yù)測(cè)有助于進(jìn)一步了解GRAS家族成員在核桃體內(nèi)發(fā)揮的功能。

GRAS蛋白功能呈多樣性，并在不同品種、不同組織和不同生長(zhǎng)階段所發(fā)揮的作用不盡相同［25-26］。目前，模式植物擬南芥的GRAS基因家族中的多個(gè)亞家族成員的功能已被驗(yàn)證［27］。本研究將同一砧木嫁接‘遼寧8號(hào)’（耐低溫）和‘清香’（不耐低溫）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，核桃葉片中有多個(gè)GRAS家族成員響應(yīng)低溫處理14個(gè)DEGs，響應(yīng)情況不盡相同。探索GRAS基因家族在核桃不同品種的表達(dá)差異有助于更好地了解其抗性表達(dá)，結(jié)合生物信息學(xué)進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析的準(zhǔn)確性。這些研究將為我們解析核桃GRAS基因功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。