鄭雪晴，王 帆,2，楊軍玉，韓澤園，王亞南，曹克強(qiáng)，王樹桐

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/植物病害流行與綜合防治實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001；2. 蔚縣氣象局，河北 張家口 075700）

由黑腐皮殼屬（Valsa maliMayabe et Yamada）引起的蘋果樹腐爛病是一種毀滅性病害［1］，嚴(yán)重威脅我國蘋果產(chǎn)業(yè)［2］。生產(chǎn)上以使用傳統(tǒng)的化學(xué)殺菌劑來控制腐爛病發(fā)展，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用也給環(huán)境生態(tài)造成了巨大壓力［3］。因此，需要一種更安全、更長效病害控制措施［4］，生物防治或是一種理想的替代方法。

生物防治主要是利用細(xì)菌、真菌及其它微生物來抑制病原菌的生長［5］，促進(jìn)植物健康生長等［6］，目前一些微生物已被研究作為真菌病害生物防治的候選菌株［7］。在蘋果樹腐爛病生物防治研究領(lǐng)域，鄧振山等［8］篩選出的拮抗內(nèi)生真菌；薛應(yīng)鈺等［9］從蘋果根際土壤中篩選得到的放線菌菌株均對(duì)蘋果樹腐爛病菌有較強(qiáng)的拮抗作用。在細(xì)菌研究方面，以芽胞桿菌類應(yīng)用最為廣泛［10］，豆雅楠等［11］從敦煌鹽堿地中分離出的枯草芽胞桿菌亞種(Bacillus subtilissubsp.spizizenii)發(fā)酵原液在離體枝條試驗(yàn)中可以完全抑制腐爛病菌生長；何姣等［12］分離出的解淀粉芽胞桿菌能有效抑制蘋果樹腐爛病菌，有一定的生防潛力。但這些菌株多為單一菌株，存在諸如菌株作用譜窄、持效性差、環(huán)境依賴性強(qiáng)等弊端,不能達(dá)到理想的防病效果［13］。因此, 通過菌劑組合來提高生防效果和穩(wěn)定性、延長生防菌的作用期限顯得尤為重要。

本研究通過室內(nèi)和田間試驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)試了前期篩選獲得的8株細(xì)菌對(duì)腐爛病菌的拮抗作用及對(duì)蘋果枝條傷口的促愈作用；將拮抗效果突出的菌株與促愈效果突出的菌株兩兩組合，通過離體蘋果枝條和田間試驗(yàn)分別測(cè)試了8株單一菌株與菌株組合對(duì)腐爛病的防治效果，以期為蘋果樹腐爛病生物防治提供材料和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：蘋果樹腐爛病菌（Valsa mali）Vmm41，解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）X-1、Y5、BV2007和ND-7菌株，貝萊斯芽胞桿菌（B. velezensis）X-2、X-3、X-4和40-6，均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

供試枝條：2～3年生健康富士蘋果枝條，于0～3 ℃ 冷庫中短期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生防菌菌株發(fā)酵液的制備

用滅菌牙簽挑取供試生防菌菌株單菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，220 r/min震蕩培養(yǎng)48 h制成種子液；取種子液5 mL接種于80 mL LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)48 h制備成細(xì)菌發(fā)酵液。

1.3 8株生防菌對(duì)腐爛病菌菌絲形態(tài)的影響

參照Zhou Ting［14］的試驗(yàn)方法制備載玻片。在含有載玻片的平皿里倒入PDA培養(yǎng)基，凝固后將載玻片取出，放入新的培養(yǎng)皿中，將滴有20 μL發(fā)酵液的濾紙片與腐爛病菌放在載玻片兩端，相距3.5 cm，以無菌水為對(duì)照，設(shè)4次重復(fù)，25 ℃培養(yǎng),4 d后用顯微鏡觀察病原菌菌絲形態(tài)。

1.4 8株生防菌對(duì)腐爛病的防治效果

在試驗(yàn)果園選取2～3年生富士蘋果枝條，在枝條表面打圓孔（?=8.0 mm），分別接種Y5、BV2007、X-1、X-2、X-4、X-3、40-6和ND-7的發(fā)酵液50 μL（1×109CFU/mL），保鮮膜包裹保濕。每個(gè)重復(fù)10棵樹，每處理重復(fù)5次，每棵樹10個(gè)接種點(diǎn)。以無菌水和3%甲基硫菌靈作為空白對(duì)照和陽性對(duì)照。3個(gè)月后觀察記錄接種點(diǎn)的愈合情況。

傷口愈合度=（原傷口面積－愈合剩余面積）/原傷口面積

促愈效果（%）=（處理的傷口愈合度－對(duì)照的傷口愈合度）/對(duì)照的傷口愈合度×100%

1.5 離體枝條試驗(yàn)

采集2～3年生枝條，剪取30 cm長的枝段，用75%的酒精浸泡后，用3%的次氯酸鈉消毒，無菌水沖洗，枝段兩端用液體石蠟封口，晾干。用打孔器（?=8.0 mm）在枝條表面打孔，每組處理5根枝條，每根枝條3個(gè)接種點(diǎn)。用無菌水、3%甲基硫菌靈藥劑作為空白對(duì)照和陽性對(duì)照。

1.5.1 預(yù)防效果測(cè)試 分別滴加50 μL單株或組合生防菌菌液（1×109CFU/mL）于孔內(nèi)，晾干后接種腐爛菌菌餅，用保鮮膜包裹，將離體枝條插在滅菌的濕沙粒中，48 h后去除保鮮膜和菌餅。待空白對(duì)照組全部發(fā)病后測(cè)量病斑大小，計(jì)算病斑面積。根據(jù)調(diào)查結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)病面積、發(fā)病率并計(jì)算防治效果。

1.5.2 治療效果測(cè)試 在打孔處接種腐爛病菌菌餅，保鮮膜包裹保濕，25 ℃培養(yǎng)，待接種部位發(fā)病后（約60 h）刮除病斑，涂抹單株或組合生防菌菌液50 μL（1×109CFU/mL），晾干后繼續(xù)保濕培養(yǎng)。待空白對(duì)照組病斑全部復(fù)發(fā)后測(cè)量病斑大小，計(jì)算發(fā)病率、病斑面積和防治效果。

發(fā)病率=病斑數(shù)/處理數(shù)×100%

病斑面積=1/4×π×長徑×短徑

復(fù)發(fā)病斑面積=第二次測(cè)量病斑面積－第一次測(cè)量病斑面積

防治效果=（對(duì)照組復(fù)發(fā)病斑面積－處理組復(fù)發(fā)病斑面積）/對(duì)照組復(fù)發(fā)病斑面積×100%

1.6 田間試驗(yàn)

選取長勢(shì)相近的30棵盆栽富士樹，選2～3年生健康枝條，在枝條表面打圓孔（?=8.0 mm）。以無菌水、3%甲基硫菌靈分別作空白對(duì)照和陽性對(duì)照。1.6.1 預(yù)防效果測(cè)試 分別滴加50 μL組合生防菌菌液（1×109CFU/mL）于孔內(nèi)，保鮮膜包裹。3 d后接種腐爛病菌菌餅（?=8.0 mm），再包裹7 d，每重復(fù)3個(gè)接種點(diǎn)，每處理重復(fù)5次。觀察記錄接種點(diǎn)的發(fā)病情況，計(jì)算病斑面積和防治效果。

1.6.2 治療效果測(cè)試 在處理后枝條的打孔處接種腐爛病菌菌餅（?=8.0 mm），保鮮膜包裹，約7 d后接種部位顯癥，用刮刀將病斑全部刮凈，涂抹50 μL組合生防菌菌液（1×109CFU/mL）保鮮膜包裹保濕，待對(duì)照組發(fā)病后觀察腐爛病的復(fù)發(fā)情況，計(jì)算發(fā)病率、病斑面積和防治效果。計(jì)算方法同上。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差法分析，利用LSD法和Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，置信度p=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 8株生防菌對(duì)腐爛病菌菌絲生長的拮抗作用以及對(duì)枝條傷口的促愈作用

8株生防菌均對(duì)蘋果樹腐爛病菌菌絲生長有明顯抑制效果，其中X-1、Y5和BV200菌株抑菌率較高，均達(dá)到55%以上，為拮抗菌株。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，8株生防菌對(duì)枝條傷口愈合均有不同程度促進(jìn)作用，其中菌株X-2、ND-7、BV2007和X-3的促愈效果均為25% 以上，顯著高于清水對(duì)照，與甲基硫菌靈的促愈效果無顯著差異（P＜0.05），為促生菌株（見表1）。

表1 8株生防菌對(duì)腐爛病菌的拮抗作用以及對(duì)蘋果枝條傷口的促愈作用Table 1 Antagonistic effect of eight strains of biocontrol bacterial strains on Valsa mali and their effect of promoting the healing of apple branch wound

2.2 8株生防菌株對(duì)病原真菌菌絲形態(tài)的影響

通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)的腐爛病菌菌絲粗細(xì)均勻、表面光滑，菌絲細(xì)長（圖1-a）；而與8株生防菌對(duì)峙培養(yǎng)4 d后的腐爛病菌菌絲從頂端數(shù)第一個(gè)分支與第二個(gè)分支間菌絲長度縮短、菌絲不規(guī)則，彎曲、分支增多、變粗（圖1-b～i）。表明生防菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)對(duì)腐爛病菌菌絲的形態(tài)有明顯影響。

圖1 菌絲形態(tài)觀察圖Fig.1 Mycelial morphology

2.3 離體枝條測(cè)定生防菌株組合菌液對(duì)蘋果樹腐爛病的防治效果

通過離體枝條試驗(yàn)測(cè)試了11個(gè)生防菌株組合與6個(gè)單一菌株菌液對(duì)腐爛病離體枝條的治療效果和預(yù)防效果。結(jié)果表明，Y5+ND-7、Y5+BV2007、BV2007+ND-7、BV2007+X-2的治療效果分別為52.32%、44.78%、43.53%和41.75%，其 余 菌 株組合的防效均低于40%；而BV2007的治療效果達(dá)到51.54%。菌株組合Y5+X-3、Y5+BV2007、BV2007+X-2、X-1+ND-7、X-1+BV2007、X-1+X-2預(yù)防效果分別達(dá)到58.84%、53.36%、51.93%、49.94%、44.79%和42.30%，其余菌株組合的防效均低于40%；單一菌株BV2007、Y5、X-1、ND-7、X-2、X-3的防效均可達(dá)到63%以上。綜合來看，組合生防菌的治療效果和預(yù)防效果不高于單一菌株的防效（見表2）。

表2 11個(gè)菌株組合與6個(gè)單一菌株對(duì)離體枝條腐爛病的保護(hù)和治療作用Table 2 Protective and therapeutic effects of eleven composite strains and six single strains on apple Valsa canker in vitro branches

續(xù)表：

2.4 田間試驗(yàn)測(cè)定生防菌株組合菌液對(duì)蘋果樹腐爛病的防治效果

選取離體枝條試驗(yàn)篩選出防效較好的8個(gè)組合生防菌X-1+X-2、X-1+BV2007、X-1+ND-7、Y5+X-3、Y5+BV2007、Y5+ND-7、BV2007+X-2和BV2007+ND-7進(jìn)行田間試驗(yàn)，結(jié)果表明：BV2007+ND-7的保護(hù)防效最好，達(dá)到了58.56%，與陽性對(duì)照防效無顯著差異；BV2007+ND-7和Y5+BV2007的田間治療效果較好，分別是63.83%和51.83%，與陽性對(duì)照防效無顯著差異P＞0.05（見表3）。

表3 組合生防菌對(duì)田間果樹腐爛病的保護(hù)和治療作用Table 3 The protective and therapeutic effects of combined biocontrol bacteria on apple Valsa canker in the field experiments

3 結(jié)論與討論

國內(nèi)外研究生防菌防治病害的報(bào)道越來越多，其中拮抗細(xì)菌在植物病害防治中凸顯出優(yōu)勢(shì)并發(fā)揮重要作用［15-16］。拮抗細(xì)菌，特別是芽胞桿菌［7］，可分泌多種抗菌物質(zhì)并促進(jìn)植物生長，誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性［17］，在不良環(huán)境條件下形成抗逆、耐熱的芽胞，使得微生物菌劑便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸［18］，這些特性使得芽胞桿菌成為生產(chǎn)上應(yīng)用最為廣泛的拮抗微生物。

傳統(tǒng)的生物防治大多采用單一菌株防治單一病害，但生防菌使用中受不同生態(tài)條件、微生物區(qū)系以及生防菌自身不穩(wěn)定等因素的影響，難以達(dá)到理想防效［19］。生防菌組合使用可在一定程度上解決單一菌株適應(yīng)性差、環(huán)境依賴性強(qiáng)、防治效果偏低的問題。研究表明，利用生防細(xì)菌復(fù)合菌劑防治辣椒青枯病，與單一菌株相比, 菌株組合更能適應(yīng)不同的土壤、多種病原物和環(huán)境變化，從而減輕病害的發(fā)生程度［20-21］。

關(guān)于生防菌株組合后提高對(duì)植物病害的防治效果已有大量研究。例如許艷麗等［22］發(fā)現(xiàn)木霉菌FMM35和FMM9組合后，對(duì)大豆根腐病有防治效果；Marjan等［23］將2株具有不同生防機(jī)制的假單胞菌組合，發(fā)現(xiàn)該組合對(duì)蘿卜枯萎病有防治效果。但尚未見生防細(xì)菌組合后用于蘋果樹腐爛病的防治報(bào)道，本研究嘗試將拮抗效果較好的菌株與促生效果較好的菌株進(jìn)行組合用于防治蘋果樹腐爛病，離體枝條試驗(yàn)表明有較單一菌株防效提高的生防菌組合，但也有組合菌防效降低的現(xiàn)象，這與張雪艷等［24］的研究觀點(diǎn)一致。陳志誼等［25］認(rèn)為菌株組合在生產(chǎn)實(shí)踐中，不一定會(huì)表現(xiàn)出增效，甚至可能會(huì)出現(xiàn)減效，只有在引入的位點(diǎn)群體增長后，才有可能表現(xiàn)出增效作用，這一說法與本研究發(fā)現(xiàn)基本吻合。后續(xù)將進(jìn)一步優(yōu)化菌株組合，改進(jìn)配比濃度，從時(shí)間或者空間上進(jìn)行菌株的組合，以便混合菌株能夠定殖生長，為研發(fā)高防效、更適應(yīng)田間應(yīng)用的生防菌劑提供理論依據(jù)。