鄭雪晴，王 帆,2，楊軍玉，韓澤園，王亞南，曹克強(qiáng)，王樹桐

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/植物病害流行與綜合防治實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001；2. 蔚縣氣象局，河北 張家口 075700）

由黑腐皮殼屬（Valsa maliMayabe et Yamada）引起的蘋果樹腐爛病是一種毀滅性病害［1］，嚴(yán)重威脅我國蘋果產(chǎn)業(yè)［2］。生產(chǎn)上以使用傳統(tǒng)的化學(xué)殺菌劑來控制腐爛病發(fā)展，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用也給環(huán)境生態(tài)造成了巨大壓力［3］。因此，需要一種更安全、更長效病害控制措施［4］，生物防治或是一種理想的替代方法。

生物防治主要是利用細(xì)菌、真菌及其它微生物來抑制病原菌的生長［5］，促進(jìn)植物健康生長等［6］，目前一些微生物已被研究作為真菌病害生物防治的候選菌株［7］。在蘋果樹腐爛病生物防治研究領(lǐng)域，鄧振山等［8］篩選出的拮抗內(nèi)生真菌；薛應(yīng)鈺等［9］從蘋果根際土壤中篩選得到的放線菌菌株均對蘋果樹腐爛病菌有較強(qiáng)的拮抗作用。在細(xì)菌研究方面，以芽胞桿菌類應(yīng)用最為廣泛［10］，豆雅楠等［11］從敦煌鹽堿地中分離出的枯草芽胞桿菌亞種(Bacillus subtilissubsp.spizizenii)發(fā)酵原液在離體枝條試驗(yàn)中可以完全抑制腐爛病菌生長；何姣等［12］分離出的解淀粉芽胞桿菌能有效抑制蘋果樹腐爛病菌，有一定的生防潛力。但這些菌株多為單一菌株，存在諸如菌株作用譜窄、持效性差、環(huán)境依賴性強(qiáng)等弊端,不能達(dá)到理想的防病效果［13］。因此, 通過菌劑組合來提高生防效果和穩(wěn)定性、延長生防菌的作用期限顯得尤為重要。

本研究通過室內(nèi)和田間試驗(yàn)系統(tǒng)測試了前期篩選獲得的8株細(xì)菌對腐爛病菌的拮抗作用及對蘋果枝條傷口的促愈作用；將拮抗效果突出的菌株與促愈效果突出的菌株兩兩組合，通過離體蘋果枝條和田間試驗(yàn)分別測試了8株單一菌株與菌株組合對腐爛病的防治效果，以期為蘋果樹腐爛病生物防治提供材料和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：蘋果樹腐爛病菌（Valsa mali）Vmm41，解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）X-1、Y5、BV2007和ND-7菌株，貝萊斯芽胞桿菌（B. velezensis）X-2、X-3、X-4和40-6，均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

供試枝條：2～3年生健康富士蘋果枝條，于0～3 ℃ 冷庫中短期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生防菌菌株發(fā)酵液的制備

用滅菌牙簽挑取供試生防菌菌株單菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，220 r/min震蕩培養(yǎng)48 h制成種子液；取種子液5 mL接種于80 mL LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)48 h制備成細(xì)菌發(fā)酵液。

1.3 8株生防菌對腐爛病菌菌絲形態(tài)的影響

參照Zhou Ting［14］的試驗(yàn)方法制備載玻片。在含有載玻片的平皿里倒入PDA培養(yǎng)基，凝固后將載玻片取出，放入新的培養(yǎng)皿中，將滴有20 μL發(fā)酵液的濾紙片與腐爛病菌放在載玻片兩端，相距3.5 cm，以無菌水為對照，設(shè)4次重復(fù)，25 ℃培養(yǎng),4 d后用顯微鏡觀察病原菌菌絲形態(tài)。

1.4 8株生防菌對腐爛病的防治效果

在試驗(yàn)果園選取2～3年生富士蘋果枝條，在枝條表面打圓孔（?=8.0 mm），分別接種Y5、BV2007、X-1、X-2、X-4、X-3、40-6和ND-7的發(fā)酵液50 μL（1×109CFU/mL），保鮮膜包裹保濕。每個重復(fù)10棵樹，每處理重復(fù)5次，每棵樹10個接種點(diǎn)。以無菌水和3%甲基硫菌靈作為空白對照和陽性對照。3個月后觀察記錄接種點(diǎn)的愈合情況。

傷口愈合度=（原傷口面積－愈合剩余面積）/原傷口面積

促愈效果（%）=（處理的傷口愈合度－對照的傷口愈合度）/對照的傷口愈合度×100%

1.5 離體枝條試驗(yàn)

采集2～3年生枝條，剪取30 cm長的枝段，用75%的酒精浸泡后，用3%的次氯酸鈉消毒，無菌水沖洗，枝段兩端用液體石蠟封口，晾干。用打孔器（?=8.0 mm）在枝條表面打孔，每組處理5根枝條，每根枝條3個接種點(diǎn)。用無菌水、3%甲基硫菌靈藥劑作為空白對照和陽性對照。

1.5.1 預(yù)防效果測試 分別滴加50 μL單株或組合生防菌菌液（1×109CFU/mL）于孔內(nèi)，晾干后接種腐爛菌菌餅，用保鮮膜包裹，將離體枝條插在滅菌的濕沙粒中，48 h后去除保鮮膜和菌餅。待空白對照組全部發(fā)病后測量病斑大小，計(jì)算病斑面積。根據(jù)調(diào)查結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)病面積、發(fā)病率并計(jì)算防治效果。

1.5.2 治療效果測試 在打孔處接種腐爛病菌菌餅，保鮮膜包裹保濕，25 ℃培養(yǎng)，待接種部位發(fā)病后（約60 h）刮除病斑，涂抹單株或組合生防菌菌液50 μL（1×109CFU/mL），晾干后繼續(xù)保濕培養(yǎng)。待空白對照組病斑全部復(fù)發(fā)后測量病斑大小，計(jì)算發(fā)病率、病斑面積和防治效果。

發(fā)病率=病斑數(shù)/處理數(shù)×100%

病斑面積=1/4×π×長徑×短徑

復(fù)發(fā)病斑面積=第二次測量病斑面積－第一次測量病斑面積

防治效果=（對照組復(fù)發(fā)病斑面積－處理組復(fù)發(fā)病斑面積）/對照組復(fù)發(fā)病斑面積×100%

1.6 田間試驗(yàn)

選取長勢相近的30棵盆栽富士樹，選2～3年生健康枝條，在枝條表面打圓孔（?=8.0 mm）。以無菌水、3%甲基硫菌靈分別作空白對照和陽性對照。1.6.1 預(yù)防效果測試 分別滴加50 μL組合生防菌菌液（1×109CFU/mL）于孔內(nèi)，保鮮膜包裹。3 d后接種腐爛病菌菌餅（?=8.0 mm），再包裹7 d，每重復(fù)3個接種點(diǎn)，每處理重復(fù)5次。觀察記錄接種點(diǎn)的發(fā)病情況，計(jì)算病斑面積和防治效果。

1.6.2 治療效果測試 在處理后枝條的打孔處接種腐爛病菌菌餅（?=8.0 mm），保鮮膜包裹，約7 d后接種部位顯癥，用刮刀將病斑全部刮凈，涂抹50 μL組合生防菌菌液（1×109CFU/mL）保鮮膜包裹保濕，待對照組發(fā)病后觀察腐爛病的復(fù)發(fā)情況，計(jì)算發(fā)病率、病斑面積和防治效果。計(jì)算方法同上。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差法分析，利用LSD法和Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，置信度p=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 8株生防菌對腐爛病菌菌絲生長的拮抗作用以及對枝條傷口的促愈作用

8株生防菌均對蘋果樹腐爛病菌菌絲生長有明顯抑制效果，其中X-1、Y5和BV200菌株抑菌率較高，均達(dá)到55%以上，為拮抗菌株。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，8株生防菌對枝條傷口愈合均有不同程度促進(jìn)作用，其中菌株X-2、ND-7、BV2007和X-3的促愈效果均為25% 以上，顯著高于清水對照，與甲基硫菌靈的促愈效果無顯著差異（P＜0.05），為促生菌株（見表1）。

表1 8株生防菌對腐爛病菌的拮抗作用以及對蘋果枝條傷口的促愈作用Table 1 Antagonistic effect of eight strains of biocontrol bacterial strains on Valsa mali and their effect of promoting the healing of apple branch wound

2.2 8株生防菌株對病原真菌菌絲形態(tài)的影響

通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)的腐爛病菌菌絲粗細(xì)均勻、表面光滑，菌絲細(xì)長（圖1-a）；而與8株生防菌對峙培養(yǎng)4 d后的腐爛病菌菌絲從頂端數(shù)第一個分支與第二個分支間菌絲長度縮短、菌絲不規(guī)則，彎曲、分支增多、變粗（圖1-b～i）。表明生防菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)對腐爛病菌菌絲的形態(tài)有明顯影響。

圖1 菌絲形態(tài)觀察圖Fig.1 Mycelial morphology

2.3 離體枝條測定生防菌株組合菌液對蘋果樹腐爛病的防治效果

通過離體枝條試驗(yàn)測試了11個生防菌株組合與6個單一菌株菌液對腐爛病離體枝條的治療效果和預(yù)防效果。結(jié)果表明，Y5+ND-7、Y5+BV2007、BV2007+ND-7、BV2007+X-2的治療效果分別為52.32%、44.78%、43.53%和41.75%，其 余 菌 株組合的防效均低于40%；而BV2007的治療效果達(dá)到51.54%。菌株組合Y5+X-3、Y5+BV2007、BV2007+X-2、X-1+ND-7、X-1+BV2007、X-1+X-2預(yù)防效果分別達(dá)到58.84%、53.36%、51.93%、49.94%、44.79%和42.30%，其余菌株組合的防效均低于40%；單一菌株BV2007、Y5、X-1、ND-7、X-2、X-3的防效均可達(dá)到63%以上。綜合來看，組合生防菌的治療效果和預(yù)防效果不高于單一菌株的防效（見表2）。

表2 11個菌株組合與6個單一菌株對離體枝條腐爛病的保護(hù)和治療作用Table 2 Protective and therapeutic effects of eleven composite strains and six single strains on apple Valsa canker in vitro branches

續(xù)表：

2.4 田間試驗(yàn)測定生防菌株組合菌液對蘋果樹腐爛病的防治效果

選取離體枝條試驗(yàn)篩選出防效較好的8個組合生防菌X-1+X-2、X-1+BV2007、X-1+ND-7、Y5+X-3、Y5+BV2007、Y5+ND-7、BV2007+X-2和BV2007+ND-7進(jìn)行田間試驗(yàn)，結(jié)果表明：BV2007+ND-7的保護(hù)防效最好，達(dá)到了58.56%，與陽性對照防效無顯著差異；BV2007+ND-7和Y5+BV2007的田間治療效果較好，分別是63.83%和51.83%，與陽性對照防效無顯著差異P＞0.05（見表3）。

表3 組合生防菌對田間果樹腐爛病的保護(hù)和治療作用Table 3 The protective and therapeutic effects of combined biocontrol bacteria on apple Valsa canker in the field experiments

3 結(jié)論與討論

國內(nèi)外研究生防菌防治病害的報(bào)道越來越多，其中拮抗細(xì)菌在植物病害防治中凸顯出優(yōu)勢并發(fā)揮重要作用［15-16］。拮抗細(xì)菌，特別是芽胞桿菌［7］，可分泌多種抗菌物質(zhì)并促進(jìn)植物生長，誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性［17］，在不良環(huán)境條件下形成抗逆、耐熱的芽胞，使得微生物菌劑便于儲存和運(yùn)輸［18］，這些特性使得芽胞桿菌成為生產(chǎn)上應(yīng)用最為廣泛的拮抗微生物。

傳統(tǒng)的生物防治大多采用單一菌株防治單一病害，但生防菌使用中受不同生態(tài)條件、微生物區(qū)系以及生防菌自身不穩(wěn)定等因素的影響，難以達(dá)到理想防效［19］。生防菌組合使用可在一定程度上解決單一菌株適應(yīng)性差、環(huán)境依賴性強(qiáng)、防治效果偏低的問題。研究表明，利用生防細(xì)菌復(fù)合菌劑防治辣椒青枯病，與單一菌株相比, 菌株組合更能適應(yīng)不同的土壤、多種病原物和環(huán)境變化，從而減輕病害的發(fā)生程度［20-21］。

關(guān)于生防菌株組合后提高對植物病害的防治效果已有大量研究。例如許艷麗等［22］發(fā)現(xiàn)木霉菌FMM35和FMM9組合后，對大豆根腐病有防治效果；Marjan等［23］將2株具有不同生防機(jī)制的假單胞菌組合，發(fā)現(xiàn)該組合對蘿卜枯萎病有防治效果。但尚未見生防細(xì)菌組合后用于蘋果樹腐爛病的防治報(bào)道，本研究嘗試將拮抗效果較好的菌株與促生效果較好的菌株進(jìn)行組合用于防治蘋果樹腐爛病，離體枝條試驗(yàn)表明有較單一菌株防效提高的生防菌組合，但也有組合菌防效降低的現(xiàn)象，這與張雪艷等［24］的研究觀點(diǎn)一致。陳志誼等［25］認(rèn)為菌株組合在生產(chǎn)實(shí)踐中，不一定會表現(xiàn)出增效，甚至可能會出現(xiàn)減效，只有在引入的位點(diǎn)群體增長后，才有可能表現(xiàn)出增效作用，這一說法與本研究發(fā)現(xiàn)基本吻合。后續(xù)將進(jìn)一步優(yōu)化菌株組合，改進(jìn)配比濃度，從時間或者空間上進(jìn)行菌株的組合，以便混合菌株能夠定殖生長，為研發(fā)高防效、更適應(yīng)田間應(yīng)用的生防菌劑提供理論依據(jù)。