杜萍萍，趙穎佳，史桂清，肖 凱

( 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河北 保定 071001)

小麥等禾谷類作物生長過程中植株經(jīng)常會遭受干旱逆境脅迫，造成作物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成能力的限制［1-2］。提高作物植株對干旱逆境抵抗能力，對于促進我國水資源可持續(xù)利用和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要實踐意義。

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor）通過與下游基因啟動子區(qū)順式作用元件（Cis-element）特異性結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄效率，在增強植株抵御干旱逆境能力中發(fā)揮重要作用［3-4］。近年來研究表明，核因子Y（NF-Y）是植物種屬轉(zhuǎn)錄因子中的1個重要家族。該 因 子由NF-YA、NF-YB和NF-YC 3種亞基 組成［5-6］。其中，NF-YA亞基含有1個負責(zé)與NFYB/NF-YC結(jié)合的N端結(jié)構(gòu)域和1個特定識別下游基因啟動子區(qū)CCAAT元件的C-末端結(jié)構(gòu)域［7-8］。當(dāng)NF-YB和NF-YC亞基與NF-YA形成三聚體復(fù)合物后，通過后者識別下游基因CCAAT元件，與靶基因DNA互作，啟動基因的轉(zhuǎn)錄［9-10］。

迄今，有關(guān)NF-Y轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植株生長、發(fā)育和逆境防御的研究已有較多報道。Kumimoto等證實，擬南芥植株誘導(dǎo)開花時NF-YB3和NF-YB2表達增強，上述基因參與植株成花特性的調(diào)節(jié)［11］。部分NF-Y亞基通過調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，參與豆科作物植株根瘤形成、始花期、藍光反應(yīng)和葉綠體發(fā)育的調(diào)控［12-15］。擬南芥NF-YB2和玉米中該基因的同源基因ZmNF-YB2通過增強干旱逆境下植株光合碳同化和干旱適應(yīng)生理過程，在介導(dǎo)植株抵御干旱逆境中發(fā)揮重要作用［15］。上述研究表明，NF-Y家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植株生長、發(fā)育和逆境響應(yīng)生物學(xué)過程。

盡管前人圍繞植物種屬NF-Y家族轉(zhuǎn)錄因子基因分子特征和生物學(xué)功能開展了較多研究［12-15］，但迄今有關(guān)小麥該家族基因的功能鑒定仍報道較少。本研究以實驗室前期小麥干旱轉(zhuǎn)錄組分析中鑒定的1個歸屬于NF-YB家族成員（TaNF-YB4）為基礎(chǔ)，對該基因分子特征、應(yīng)答干旱逆境表達模式及其介導(dǎo)植株抵御干旱逆境的能力進行了鑒定，以期通過本項研究豐富小麥抗旱分子機理的認識，為今后小麥抗旱遺傳改良和節(jié)水栽培實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TaNF-YB4分子特征分析

作者前期通過對小麥干旱脅迫后的根系進行高通量轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定了1個歸屬于NF-YB轉(zhuǎn)錄因子家族基因TaNF-YB4（登錄號：AK457878.1，因其與已報道植物種屬NF-YB4序列同源予以命名）。利用ExPASY（https://web.expasy.org/protparam/）在線分析工具，對TaNF-YB4編碼蛋白的分子量（MW）和等電點（pI）進行預(yù)測。利用DNAMAN生物學(xué)軟件進行供試基因編碼蛋白與不同植物種屬同源蛋白保守序列多重氨基酸序列比對分析。以TaNF-YB4作為對象進行GenBank數(shù)據(jù)庫（NCBI）同源查找，獲得與目標(biāo)基因同源的不同種屬基因。采用MEGA 7軟件建立了TaNF-YB4與其植物種屬同源基因的系統(tǒng)進化樹。

1.2 TaNF-YB4應(yīng)答干旱脅迫逆境表達模式鑒定

以小麥品種‘石麥22’為材料，參考實驗室建立的小麥幼苗水培方法（Hoagland營養(yǎng)液）培養(yǎng)小麥幼苗至三葉期。然后將幼苗轉(zhuǎn)入含有10%聚乙二醇（PEG-6000）營養(yǎng)液進行模擬干旱處理。處理1、3、9、27 h后收取根、葉樣本。此外，為鑒定TaNF-YB4表達對恢復(fù)處理的響應(yīng)，將部分經(jīng)過27 h干旱處理的幼苗再度轉(zhuǎn)入正常營養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)3 h（R3 h）、9 h（R9 h）和27 h（R27 h）恢復(fù)處理后，分別收獲根、葉樣本。以干旱處理前（0 h）根、葉樣本做對照。采用TRIzol試劑盒參照說明書提取根、葉樣本RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV進行提取RNA中mRNA反轉(zhuǎn)錄，進而以轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為實時定量PCR的模板。用于擴增TaNF-YB4的正向引物為5'- CCATCTCCGTCCATCTCCCTCC，反向引物為5'- TACCTTACACGAGCGAAAGACTG。

1.3 正反義表達TaNF-YB4煙草轉(zhuǎn)化株系建立

采用DNA重組技術(shù)構(gòu)建將TaNF-YB4正、反義序列融合至雙元表達載體pCAMBIA3301的雙元表達載體。其中，擴增靶基因正義序列引物為5'- AAAAGATCTGATGTCGGAGGCGGTGGGC（正向）和5'- AAAGGTTACCTTACACGAGCGAAAG（反向）；擴增靶基因反義序列引物為5'- AAAAGATCTTGGAAAAGGCGTATCTCT（正向）和5'- AAAGGTAACCATCTCCCTCCTAATTA（反向）。參照Sun等［16］的方法建立正、反義表達TaNF-YB4的煙草轉(zhuǎn)化株系。

1.4 TaNF-YB4煙草轉(zhuǎn)化株系干旱處理下植株形態(tài)性狀鑒定

將野生型對照（WT）、TaNF-YB4正義表達典型株系（Sen 1）和反義表達典型株系（Anti 2）與Hoagland營養(yǎng)液中正常培養(yǎng)。五葉期時，選取長勢一致的WT和轉(zhuǎn)化株系幼苗，進行正常營養(yǎng)液處理（對照組）和干旱處理（營養(yǎng)液內(nèi)補充5% PEG-6000）。處理期間每5 d更換一次營養(yǎng)液。處理4周后用相機拍照記錄不同處理下各供試材料植株長勢。此外，選取處理后代表性WT、正義系和反義系各3株，用葉面積儀測定植株葉面積后稱取鮮重，再將植株樣本烘干稱重獲得植株干質(zhì)量。

1.5 TaNF-YB4煙草轉(zhuǎn)化株系應(yīng)答干旱的氣孔關(guān)閉特征鑒定

選取代表性WT、正義系和反義系植株，在含有5% PEG-6000營養(yǎng)液內(nèi)進行干旱處理。利用顯微鏡觀測處理前對照（0 h）和處理后不同時間點（0.25、0.5和1 h）葉片氣孔開度。各材料不同處理時間點觀測氣孔樣本數(shù)量均為50個，以典型氣孔觀測結(jié)果表示氣孔開度特征。

1.6 TaNF-YB4煙草轉(zhuǎn)化株系生理生化指標(biāo)測定

以正常培養(yǎng)和干旱處理 4 周后WT、Sen 1和Anti 2植株為樣本，參照 guo等的方法測定光合參數(shù)，包括光合速率（Pn）、胞間 CO2濃度（Ci）、光系統(tǒng) II 光化學(xué)活性 （ΨPSII）和葉綠體光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）［17］。參照Du等的方法測定可溶蛋白和可溶性糖含量［18］。參照Huang等的方法測定細胞活性氧穩(wěn)態(tài)相關(guān)參數(shù)，包括超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和過氧化物酶（POD）活性［19］。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

采用Microsoft Excel和DPS 7.05軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。各測定數(shù)據(jù)均源于3次測試重復(fù)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaNF-YB4分子特征

TaNF-YB4（登錄號AK457878）cDNA序列全長為1 018 bp，其開放閱讀框為411 bp，編碼136個氨基酸殘基多肽鏈。TaNF-YB4蛋白分子量為14.93 kD，等電點（pI）為5.65。蛋白保守域預(yù)測表明，TaNF-YB4蛋白含有1個NF-YB型轉(zhuǎn)錄因子家族成員具有的保守H4超家族結(jié)構(gòu)域（圖1A）和核定位信號區(qū)（aa19～aa83）（圖1B）。基因系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，在核苷酸水平上，TaNF-YB4與源于油棕、菠蘿、大麥、普通小麥、一粒小麥、水稻和粟等植物的NF-YB型轉(zhuǎn)錄因子家族基因高度同源（圖1C）。表明上述基因可能具有相似的進化途徑。

2.2 TaNF-YB4應(yīng)答干旱脅迫表達模式

與正常生長條件下小麥根系和葉片TaNF-YB4相對較低的轉(zhuǎn)錄水平相比，干旱處理下該基因表達上調(diào)，在根葉中均表現(xiàn)在干旱處理27 h時間內(nèi)隨著處理進程TaNF-YB4表達水平不斷增高（圖2）。將干旱處理27 h植株轉(zhuǎn)入正常生長的恢復(fù)處理后，在根葉該基因的表達水平下調(diào)，呈隨著恢復(fù)處理進程表達水平不斷降低特征（圖2）。上述結(jié)果表明，TaNF-YB4轉(zhuǎn)錄呈典型的干旱逆境應(yīng)答模式。

圖 1 TaNF-YB4分子特征Fig. 1 Molecular characterization of TaNF-YB4

圖2 干旱處理下根葉TaNF-YB4表達模式Fig. 2 Expression patterns of TaNF-YB4 in roots and leaves under drought treatment

2.3 干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系表型和植株生長特征

正常培養(yǎng)條件下，與野生型對照（Wild type, WT）相比，TaNF-YB4正義表達株系（Sen 1）和反義表達株系（Anti 2）植株長勢相近（圖3）。干旱處理下，與WT相比，Sen 1植株長勢顯著增強，而Anti 2植株長勢明顯減弱（圖3）。上述結(jié)果表明，TaNF-YB4在植株響應(yīng)干旱逆境過程中發(fā)揮正向調(diào)控作用。

圖3 正常生長和干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系植株長勢Fig. 3 Growth of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

對不同處理下轉(zhuǎn)化株系和WT植株形態(tài)學(xué)性狀測試取得與植株表型特征相吻合結(jié)果。正常生長條件下，轉(zhuǎn)化株系（Sen 1和Anti 2）單株鮮重、干質(zhì)量和葉面積與WT相比無明顯改變（圖4）。干旱處理下，與WT相比，Sen 1單株鮮重、干質(zhì)量和葉面積顯著增大，而Anti 2上述植株形態(tài)學(xué)性狀則較WT顯著降低（圖4）。

圖4 正常生長和干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系形態(tài)學(xué)性狀Fig. 4 Morphological traits of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

2.4 干旱處理下轉(zhuǎn)化株系葉片氣孔關(guān)閉特征

通過氣孔顯微觀測，明確了遺傳轉(zhuǎn)化TaNF-YB4對干旱處理下氣孔運動特性的影響。與WT相比，Sen 1株系氣孔在1 h 內(nèi)干旱處理下表現(xiàn)為隨著處理進程氣孔關(guān)閉速率加快，在干旱處理0.5～1 h期間其氣孔開度明顯小于WT植株（圖5）。

圖5 干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系氣孔關(guān)閉特征Fig. 5 Stomatal closure properties of the TaNF-YB4 transgenic lines under drought treatment

與Sen 1表現(xiàn)相反，Anti 2株系氣孔在1 h內(nèi)干旱處理下表現(xiàn)為隨著處理進程氣孔關(guān)閉速率減慢（圖5）。上述結(jié)果表明，TaNF-YB4通過調(diào)控植株氣孔在干旱處理下的氣孔關(guān)閉，在一定程度上調(diào)控植株蒸騰和保水能力。

2.5 干旱處理下轉(zhuǎn)化株系光合特性、可溶蛋白和可溶性糖含量

正常處理下，TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系（Sen 1和Anti 2）光合參數(shù)、可溶蛋白及可溶性糖含量與WT相比無明顯差異（圖6、圖7）。干旱處理下，與WT相比，Sen 1 株系的葉片光合速率和ΨPSII功能、可溶蛋白和可溶性糖含量速率（Pn）以及光系統(tǒng) II光化學(xué)效率（ФPSII）顯著增高，胞間CO2濃度（Ci）和NPQ降低，可溶蛋白和可溶性糖含量增加；Anti 2上述生理參數(shù)的表現(xiàn)則與Sen 1相反（圖6、圖7）。表明TaNF-YB4對干旱逆境下植株的光合特性和碳氮代謝能力具有重要影響。

圖6 正常生長和干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系形態(tài)學(xué)性狀Fig. 6 Photosynthetic parameters of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

圖7正常生長和干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系可溶蛋白和可溶性糖含量Fig. 7 Soluble protein and sugar contents of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

2.6 干旱處理下轉(zhuǎn)化株系細胞保護系統(tǒng)參數(shù)

正常處理下，TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系（Sen 1和Anti 2）SOD活性、CAT活性、POD活性和MDA與WT無明顯差異（圖8)。

干旱處理下，與WT相比，Sen 1株系上述細胞保護酶活性增高，MDA 含量降低；而Anti 2 株系上述細胞保護酶活性降低，MDA 含量增高（圖8)。上述結(jié)果表明，TaNF-YB4通過參與干旱脅迫下細胞活性氧（ROS）穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，參與植株對干旱逆境的抵御過程。

圖8 正常生長和干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系細胞活性氧穩(wěn)態(tài)相關(guān)參數(shù)Fig. 8 Cellular ROS-associated parameters of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

3 討論

NF-Y型轉(zhuǎn)錄因子家族基因在植株生長、發(fā)育和非生物逆境響應(yīng)和適應(yīng)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控效應(yīng)［12-15］。其中，部分該家族成員如大豆GmNF-YA3和白楊pdNF-YB7呈干旱脅迫下誘導(dǎo)表達模式，在介導(dǎo)植株抵御干旱逆境中發(fā)揮重要功能［20,21］。本研究對歸屬與小麥NF-YB家族基因TaNF-YB4分子特征、應(yīng)答干旱脅迫表達和遺傳轉(zhuǎn)化調(diào)控植株適應(yīng)干旱逆境的功能研究表明，該小麥NF-Y家族成員具有NF-YB蛋白通常具有的保守H4超家族結(jié)構(gòu)域和核定位信號區(qū)，其轉(zhuǎn)錄水平呈干旱誘導(dǎo)模式，表明該轉(zhuǎn)錄因子基因通過上調(diào)表達，參與下游基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，進而參與植株適應(yīng)和抵御干旱逆境的生物學(xué)過程。通過基因遺傳轉(zhuǎn)化株系抵御干旱逆境能力的鑒定，本研究證實TaNF-YB4上調(diào)表達后顯著增強植株抵御干旱逆境的能力。

植株抵御干旱能力的增強，與植株干旱脅迫下維持較高的光合碳同化能力、較強的蛋白和碳水化合物代謝密切相關(guān)［17］。在本研究中，通過對干旱處理下的TaNF-YB4正義和反義株系光合參數(shù)、可溶蛋白含量和可溶性糖含量的測試結(jié)果表明，與野生型對照（WT）植株相比，正義表達小麥供試基因典型株系（Sen 1）的光合能力和碳氮代謝能力顯著增強。與此相反，反義表達TaNF-YB4株系的光合能力和碳氮代謝水平較WT明顯降低。因此，維持較強干旱逆境下植株光合碳同化和碳氮代謝水平，是TaNF-YB4改善植株抵御干旱逆境能力的重要生理基礎(chǔ)。

通過調(diào)節(jié)植株葉片氣孔開閉特性，是減少干旱脅迫下植株蒸騰失水、進而增強植株適應(yīng)干旱逆境的重要機制［18］。研究證實，部分干旱防御基因通過脫落酸（ABA）依賴途徑，調(diào)控參與氣孔運動的ABA相關(guān)基因表達，促進干旱逆境下的氣孔關(guān)閉速率［15］。白楊pdNF-YB7提高植株抗旱能力與其調(diào)控氣孔開閉及維持逆境下較高細胞水勢有關(guān)［22］。本研究表明，TaNF-YB4參與了干旱脅迫下植株氣孔運動的調(diào)節(jié)，正義表達該基因株系干旱處理下氣孔關(guān)閉速率加快，在減少干旱脅迫下植株水分喪失、維持相對較高細胞水勢，進而增強植株抵御干旱脅迫過程發(fā)揮重要作用。有關(guān)TaNF-YB4調(diào)控的氣孔運動相關(guān)基因和生理機制有待進一步探討。

遭遇干旱脅迫后，植株體內(nèi)誘發(fā)活性氧清除酶的合成，SOD、CAT和POD等細胞保護酶活性增強，能有效清除逆境誘發(fā)的活性氧，維持逆境下植株活性氧相對較低水平及較強的植株代謝功能［21］。本研究對干旱處理下轉(zhuǎn)化株系的細胞活性氧穩(wěn)態(tài)相關(guān)參數(shù)進行測試分析表明，正義表達TaNF-YB4株系（Sen 1）較WT的細胞保護酶（SOD、CAT和POD）活性增強，細胞膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量降低。這表明，TaNF-YB4具有改善干旱逆境下植株活性氧清除能力，緩解細胞膜質(zhì)過氧化，進而改善干旱逆境下植株碳氮代謝、光合碳同化和植株抵御干旱逆境能力。該基因可作為小麥種質(zhì)抗旱能力強弱的重要分子評價指標(biāo)。

4 結(jié)論

TaNF-YB4與源于油棕、菠蘿、大麥、普通小麥、一粒小麥、水稻和粟等NF-YB型轉(zhuǎn)錄因子高度同源。該基因呈干旱脅迫上調(diào)表達模式，編碼蛋白定位于核內(nèi)。TaNF-YB4正義表達煙草株系顯著增強的干旱抵御能力，這與其改善干旱逆境下植株光合能力、碳氮代謝、加速氣孔關(guān)閉及改善細胞活性氧穩(wěn)態(tài)水平密切相關(guān)。