謝華松，楊澤森，魏愛紅, ，朱銓娣，莊遠杯, ，張聲源, *

1. 嘉應(yīng)學(xué)院（梅州 514031）；2. 廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護與精準(zhǔn)利用重點實驗室（梅州 514031）；3. 嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院客家藥用生物資源研究所（梅州 514031）

各種自由基所引發(fā)的氧化損傷是導(dǎo)致體內(nèi)各組織器官損傷、病變的重要原因之一，人類許多重大疾病如糖尿病、癌癥、心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變、動脈粥樣硬化等均與由自由基引起的氧化損傷密切相關(guān)[1-2]。亞硝胺的前體物質(zhì)亞硝酸鹽和胺類大量存在腌制食物中，這些前體物質(zhì)在胃液酸性條件下極易轉(zhuǎn)化為亞硝胺，亞硝胺、苯并芘和黃曲霉素是世界公認(rèn)的三大強致癌物質(zhì)[3]。研究表明，天然植物中的黃酮、多糖、有機酸、酚類等成分均具有良好的抗氧化活性和抑制亞硝化作用[4-5]。尋找安全有效、新型、天然的抗氧化及抑制亞硝化活性成分成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點，對食品藥品行業(yè)具有重要意義。

山莓（Rubus corchorifolius）是薔薇科懸鉤子屬植物，也叫作龍船泡、牛奶泡、懸鉤子、泡兒刺、三月泡、樹莓等，廣泛分布在中國除東北三省、內(nèi)蒙古、新疆、西藏以外的其他各省、市、自治區(qū)，在海拔300～1 500 m的向陽山坡、溪邊、山谷、荒地和灌木叢中生長[6-8]。在中國，山莓作為藥用植物有悠久的用藥歷史，《本草綱目》《本草拾遺》《食療本草》《名醫(yī)別錄》等多部古代醫(yī)藥典籍里都詳細(xì)記載山莓的主要功效，且用藥部位不一，藥效也不盡相同[9]。山莓根性味微苦、辛、平，具有祛風(fēng)除濕的功效，主治風(fēng)濕腰痛、痢疾、白帶、小兒疳積等癥；葉性微苦，具有消腫解毒的功效，主治多發(fā)性膿腫、乳腺炎等癥；果性味微甘、酸、溫，具有澀精益腎、助陽明目之功效，主治腎虛、遺精、遺尿等癥[8,10-11]?？梢?，山莓藥用部位不同時，其藥效不同，其潛在藥用價值較高。

山莓全株含黃酮類、鞣質(zhì)、香豆素化合物、酚性成分和皂苷等[6]，基于國內(nèi)外研究事實，推測山莓全株有潛在的抗氧化和抑制亞硝化活性，但國內(nèi)外學(xué)者對山莓莖抗氧化、抑制亞硝化活性研究少見報道。試驗對山莓莖進行抗氧化和抑制亞硝化活性評價，以期發(fā)現(xiàn)其抗氧化和抑制亞硝化活性最佳萃取部位，為山莓潛在的其他藥理作用及綜合開發(fā)利用提供參考價值和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物來源

山莓莖采自廣東省梅州市梅江區(qū)百歲山。

1.2 試劑

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三氯乙酸（C2HCl3O2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；對氨基苯磺酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水檸檬酸（C6H8O7，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鹽酸萘乙二胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；維生素C（純度≥98%，西隴科學(xué)股份有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；Q-Gard A2型超純水儀（德國Millipore公司）；BT125D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；BS110s型電子分析天平（德國Sartorius公司）；GL-25M型高速離心機（上海趙迪生物科技有限公司）；JP-100S型超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；WJX-A1000型高速多功能粉碎機（浙江省永康市紅太陽機電有限公司）；pHSJ-3F型pH計（上海精科儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 山莓莖不同極性萃取部位樣品的制備

將采摘處理后的山莓莖置于50 ℃烘箱干燥，經(jīng)粉碎機粉碎，稱取的質(zhì)量為642.51 g，按料液比1︰1（g/mL）加入無水乙醇超聲提取3次，合并提取液后減壓濃縮得到22.2 g乙醇提取物。取17.2 g乙醇提取物分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，收集各個有機層萃取液，進行減壓濃縮，干燥，得到石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層4個不同極性萃取部位，儲存于冰箱，備用。

1.4.2 抗氧化活性評價

此部分試驗參照國內(nèi)外期刊曾報道的方法[12-14,17]。

1.4.2.1 DPPH法[12,17]

精密移取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品或VC溶液，分別加入1.0 mL 0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液，置于暗處，室溫反應(yīng)20 min，以無水乙醇溶劑做空白對照，測定其在波長517 nm處的吸光度（Ai）；測定1.0 mL 0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液與1.0 mL無水乙醇混合后在波長517 nm處的吸光度（A0）；測定1.0 mL無水乙醇溶液與1.0 mL樣品溶液在波長517 nm處的吸光度（Aj）。并根據(jù)式（1）計算出樣品和VC溶液對DPPH自由基的清除率。

1.4.2.2 ABTS法[13,17]

將7.0 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀等體積混合，置于暗處反應(yīng)12～16 h，制備得到ABTS工作液。ABTS工作液用10 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.4）進行稀釋，直到工作液在734 nm處吸光度為（0.70±0.02），避光室溫保存?zhèn)溆?。分別精密移取100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品和VC溶液于試管中，各試管加入3.9 mL ABTS工作液，振蕩，于暗處室溫反應(yīng)10 min，測定其在波長734 nm處的吸光度（Ai）。同法測定3.9 mL ABTS工作液與100 μL無水乙醇混合后在波長734 nm處的吸光度（A0），3.9 mL 10 mmol/L磷酸緩沖溶液與100 μL樣品溶液在波長734 nm處的吸光度（Aj）。根據(jù)公式計算出樣品和VC溶液對ABTS自由基的清除率。計算公式同式（1）。

1.4.2.3 普魯士藍法[14,17]

精密吸取2.5 mL不同質(zhì)量濃度的樣品、2.5 mL的PBS緩沖液（0.2 mol/L、pH 6.6）和2.5 mL K3Fe(CN)6溶液于10 mL試管中充分搖勻后，在50 ℃下恒溫水浴反應(yīng)20 min，急速冷卻，加入2.5 mL三氯乙酸溶液，充分搖勻后轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，在6 000 r/min下離心10 min，取2.5 mL上清液于試管中，依次加入2.0 mL蒸餾水與0.5 mL FeCl3溶液混合均勻。用不同質(zhì)量濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)上述操作，以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），以標(biāo)準(zhǔn)VC溶液濃度（μmol/mL）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗結(jié)果表示為μmol VC/g（即鐵還原力大小用每克樣品的VC當(dāng)量表示）。

1.4.3 抑制亞硝化作用評價

此部分試驗參照國內(nèi)期刊曾報道的方法[15,17]。

1.4.3.1 鹽酸萘乙二胺法

精密吸取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品于25 mL具塞比色管中，分別依次加入2.0 mL pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，2.0 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液，混勻。在37 ℃下水浴1 h，取出，加入2.0 mL 0.4%對氨基苯磺酸，混勻，靜置5 min后，各加入1.0 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加蒸餾水至刻度，混勻，靜置15 min后在538 nm下測定吸光度，同時用VC做對照試驗。根據(jù)式（2）計算出樣品和VC溶液對亞硝酸鹽的清除率。

式中：A0為空白反應(yīng)體系的吸光度；Ai為樣品反應(yīng)體系的吸光度。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理和相關(guān)性分析

采用Origin和SPSS對數(shù)據(jù)進行處理分析，所有試驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗結(jié)果，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。利用單因素方差分析和Duncan法檢驗多組數(shù)據(jù)間差異的顯著性，以p＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。IC50值是指清除率50%時樣品所需要的質(zhì)量濃度，利用Origin軟件根據(jù)不同質(zhì)量濃度樣品溶液的清除率繪制曲線并對各曲線線性擬合，進而求出IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化活性結(jié)果

2.1.1 DPPH法

山莓莖各萃取部位對DPPH自由基的清除能力測定結(jié)果見圖1。山莓莖不同極性萃取部位和VC清除率在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度增大而增大，表現(xiàn)出良好的劑量依賴效應(yīng)。山莓莖各萃取部位的清除率在質(zhì)量濃度在0.001～0.050 mg/mL范圍內(nèi)增幅較大，乙酸乙酯層、正丁醇層和水層在質(zhì)量濃度0.050～0.200 mg/mL范圍對DPPH自由基的清除能力趨于平衡。與陽性對照物VC對比，山莓莖各萃取部位對DPPH自由基的清除能力均弱于VC。山莓莖各萃取部位對DPPH自由基的清除能力強弱依次為乙酸乙酯層＞正丁醇層＞水層＞石油醚層。質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL時，乙酸乙酯層的清除率為85.14%，正丁醇層、水層和石油醚層分別為58.29%，43.48%和8.97%。

圖1 山莓莖對DPPH自由基清除能力的影響

2.1.2 ABTS法

山莓莖清除ABTS自由基能力測定結(jié)果及IC50分別見圖2和表1。山莓莖不同極性萃取部位及VC的清除率在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度增大而增大，表現(xiàn)出良好劑量依賴效應(yīng)。質(zhì)量濃度為0.025～0.050 mg/mL時，乙酸乙酯層對ABTS自由基的清除能力趨勢大于VC，質(zhì)量濃度為0.050～0.080 mg/mL時，VC對ABTS自由基能力的清除趨勢大于山莓莖各萃取部位。山莓莖各萃取部位對ABTS自由基的清除能力強弱依次為乙酸乙酯層＞水層＞正丁醇層＞石油醚層。質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL時，乙酸乙酯層的清除率為88.30%，正丁醇層、水層、石油醚層分別為43.85%，51.22%和8.99%。

圖2 山莓莖各萃取部位及VC 對ABTS自由基的清除能力

表1 山莓莖各萃取部位和VC對ABTS自由基清除能力的IC50值（±s，n=3）

表1 山莓莖各萃取部位和VC對ABTS自由基清除能力的IC50值（±s，n=3）

注: 同豎肩標(biāo)字母不同表示差異顯著 (p＜0.05)。

樣品 IC50/(mg·mL-1)VC 0.083±0.000 55a石油醚層 0.766±0.034 0d乙酸乙酯層 0.090±0.001 8a正丁醇層 0.238±0.003 0c水層 0.199±0.001 7b

由表1可知，山莓莖各萃取部位對ABTS自由基的清除能力存在顯著性差異（p＜0.05），乙酸乙酯層對ABTS自由基清除能力比石油醚層、正丁醇層和水層強，但山莓莖不同極性萃取部位對ABTS自由基的清除能力均弱于VC。

2.1.3 普魯士藍法

VC對鐵離子還原能力的測定結(jié)果見圖3。以VC質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，得到回歸方程Y=36.768X-0.013 5，R2=0.998 7。根據(jù)山莓莖各萃取部位測出的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出鐵還原能力。

圖3 VC的鐵還原能力

山莓莖各萃取部位鐵還原能力的測定結(jié)果見圖4。正丁醇層的鐵還原能力最強，為（77.08±4.82）μmol VC/g，其次是乙酸乙酯層（57.89±4.32）μmol VC/g、水層（54.67±4.95）μmol VC/g和石油醚層（15.62±1.72）μmol VC/g，圖4中的字母不同表示差異顯著（p＜0.05），用單因素方差分析和Duncan法對山莓莖各萃取部位的鐵還原能力處理，結(jié)果顯示正丁醇層的鐵還原能力與VC、石油醚層及乙酸乙酯層存在顯著差異（p＜0.05），乙酸乙酯層的鐵還原能力與水層不存在顯著差異（p＞0.05）。

圖4 3個產(chǎn)地蓮霧果實的鐵還原能力

2.2 體外抑制亞硝化作用結(jié)果

2.2.1 鹽酸萘乙二胺法

山莓莖清除ABTS自由基能力測定結(jié)果及IC50分別見圖5和表2。在模擬人體胃液條件下，山莓莖不同極性萃取部位對亞硝酸鹽表現(xiàn)出一定程度的清除作用，且清除率在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度增加而增加，表現(xiàn)出良好的劑量依賴效應(yīng)。乙酸乙酯層的質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，其對亞硝酸鹽的清除率為80.78%，正丁醇層、水層、石油醚層對亞硝酸鹽的清除率分別為69.03%，35.45%和16.18%。

圖5 山莓莖各萃取部位對亞硝酸鹽的清除率

表2 山莓莖各萃取部位及VC對亞硝酸鹽清除作用的IC50值（±s，n=3）

表2 山莓莖各萃取部位及VC對亞硝酸鹽清除作用的IC50值（±s，n=3）

注: 同列肩標(biāo)字母不同表示差異顯著 (p＜0.05)。

樣品 IC50/(mg·mL-1)VC 0.16±0.001 1a石油醚層 43.51±0.330e乙酸乙酯層 3.90±0.052b正丁醇層 6.28±0.074c水層 17.21±0.200d

由表2所示，山莓莖各萃取部位對亞硝酸鹽清除能力有顯著差異（p＜0.05），乙酸乙酯層清除亞硝酸鹽的能力最強，但山莓莖各極性部位其清除亞硝酸鹽的能力弱于VC（IC50=0.16±0.001 1 mg/mL）。

3 討論

采用DPPH法、ABTS法和普魯士藍法3種方法對山莓莖不同極性萃取部位的抗氧化活性進行評價，結(jié)果顯示在3種方法中，山莓莖不同極性萃取部位均呈現(xiàn)出不同程度的活性，其中乙酸乙酯層對DPPH自由基、ABTS自由基清除能力最強，正丁醇層的鐵還原力能力最強，但是在各個評價體系中抗氧化能力強弱卻存在差異，DPPH法的強弱順序為乙酸乙酯層＞正丁醇層＞水層＞石油醚層，ABTS法的強弱順序為乙酸乙酯層＞水層＞正丁醇層＞石油醚層，普魯士藍法的強弱順序為正丁醇層＞乙酸乙酯層＞水層＞石油醚層，推測其中原因是抗氧化活性的3個評價方法的原理和作用機制不一樣。抑制亞硝化結(jié)果顯示，在模擬人體胃酸條件下，山莓莖不同極性萃取部位均具有一定的抑制亞硝化能力，乙酸乙酯層對亞硝酸鹽的清除能力最強，但乙酸乙酯層、水層、正丁醇層、石油醚層的抑制亞硝化能力均弱于陽性對照品VC。在后續(xù)研究中可對乙酸乙酯層進行分離提純以尋找抑制亞硝化作用活性成分。

4 結(jié)論

從天然植物中尋找具有抗氧化和抑制亞硝化作用的活性成分，是藥品食品領(lǐng)域的研究熱點之一。探究山莓莖4個不同極性萃取部位（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水層）體外抗氧化、抑制亞硝化活性，由結(jié)果可知，山莓莖不同極性萃取部位均有抗氧化作用，乙酸乙酯層對DPPH自由基、ABTS自由基清除能力最強，正丁醇層的鐵還原力能力最強；山莓莖各極性萃取部位均有抑制亞硝化作用，乙酸乙酯層是抑制亞硝化作用的最佳萃取部位。試驗結(jié)果有助于闡明山莓莖藥食兩用科學(xué)內(nèi)涵，為山莓綜合開發(fā)利用提供參考價值。