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        沙棘黃酮類物質(zhì)的提取及純化工藝

        2021-06-10 06:46:56李曉華宋緒磊
        食品工業(yè) 2021年5期
        關(guān)鍵詞:果渣粗品沙棘

        李曉華,宋緒磊

        1. 新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院(石河子 832000);2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司(北京 100015)

        沙棘果中有超過190種天然活性營養(yǎng)組分,如多種維生素、脂肪酸、氨基酸、類黃酮、酚類、萜烯類及單寧鞣質(zhì)[1]。黃酮類化合物是沙棘最重要的活性組分,主要包括異鼠李素及其配糖體、槲皮素及其配糖體、山奈酚、黃芩苷、兒茶素及楊梅酮等[2],其營養(yǎng)價值和藥用價值非常高,廣泛應(yīng)用于食品、藥品、日化等領(lǐng)域。該類提取物大多具有酚羥基結(jié)構(gòu),可溶于極性較大的有機溶劑。在黃酮類活性物質(zhì)提取方案設(shè)計,即要考慮溶解度,又要考慮物質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性。孫江曉等[3]用乙醇-水溶液提取沙棘葉中的活性組分,所得提取液以0.5~3 BV/h流速通過樹脂柱,適量水清洗樹脂柱,用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液以0.5~2 BV流速洗脫,濃縮精制后得到淺棕色提取物,其沙棘總黃酮(苷)含量為20%~40%。該方法操作簡單、易于工業(yè)化,但溶劑損失率較高,雜質(zhì)溶出率高,黃酮提取物不易從樹脂柱上洗脫,洗脫溶劑用量比較大,樹脂預(yù)制、再生過程繁瑣。

        以沙棘果渣為原料,采用索氏抽提方式提取沙棘黃酮類化合物,考察不同濃度的溶劑、提取時間、料液比對提取效果的影響;Flash快速制備色譜分離純化黃酮類提取物,綜合優(yōu)化沙棘總黃酮提取工藝和精制條件,為進(jìn)一步工業(yè)推廣提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑及儀器

        沙棘果渣(內(nèi)蒙古赤峰);石油醚(沸程60~90℃,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);乙醇(AR,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);甲醇(色譜純,阿拉丁試劑);X-5大孔樹脂(AR,杭州市拱墅區(qū)凱英儀器經(jīng)營部);鐵氰化鉀(AR,天津市化學(xué)試劑三廠);維生素C(標(biāo)準(zhǔn)品,上海如吉生物科技發(fā)展有限公司);超純水(實驗室自制)。

        LG-2010高效液相色譜(島津);PuriFlash215快速制備色譜儀(法國Interchim公司)。

        1.2 黃酮類化合物提取

        脫膠:沙棘果渣除雜自然風(fēng)干后磨粉。三口燒瓶內(nèi)加入適量果渣粉末及HCl溶液(pH 2),料液比1︰20(g/mL),55 ℃加熱2 h后過濾,適量蒸餾水洗滌濾渣至中性,干燥待用。

        脫脂:中速濾紙石油醚抽提2 h后干燥備用。取適量脫膠果渣粉末,濾紙包裹嚴(yán)密,裝入提取器內(nèi),燒瓶內(nèi)加入適量石油醚,開啟冷凝回流,加熱燒瓶至溶劑沸騰,回流抽提2 h,停止加熱,取出濾紙包,脫脂后的沙棘果渣粉末干燥后待用。索氏提取裝置如圖1所示。

        提?。悍Q取適量脫膠、脫脂后的果渣,濾紙包裹嚴(yán)密,置于提取器內(nèi),燒瓶內(nèi)裝入一定量的乙醇溶液,加熱燒瓶至溶劑沸騰,回流抽提一定時間,旋蒸濃縮提取液,得到沙棘黃酮粗品Ⅰ。分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、抽提時間對沙棘黃酮粗品產(chǎn)量及活性影響。

        圖1 索氏提取器示意圖

        1.3 黃酮類化合物色譜條件

        HPLC反相色譜條件[4]:色譜柱,DiamonsilTMC18(5 μm,250 mm×4.6 mm);流動相,甲醇-水-0.4%磷酸(40︰20︰40);流速1.2 mL/min;紫外檢測波長330 nm;柱溫25 ℃;定量方法蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物外標(biāo)法。

        1.4 黃酮類提取物純化

        FLASH快速制備色譜對沙棘果渣黃酮粗品進(jìn)行分離純化。天然植物提取物相對分子質(zhì)量較高,黃酮提取物具有極性多酚結(jié)構(gòu)和糖苷鏈,有一定親水性。色譜柱固定相選擇孔徑較大、非極性樹脂有助于黃酮粗品的吸附和展開分離,固定相樹脂選型X-5。

        表1 X-5樹脂物理性質(zhì)

        1.4.1 色譜柱裝填

        干法裝填色譜柱:將75 g樹脂勻速倒入色譜柱內(nèi),洗耳球輕輕敲打柱子兩側(cè),使樹脂高度不再下降,真空泵與色譜柱底部相接抽出樹脂中多余空氣,將樹脂層壓縮緊密,足量淋洗劑通過色譜柱,樹脂層不再因吸附溶劑而放熱(恢復(fù)室溫),停止淋洗。

        干法上樣:少量乙醇溶解500 mg沙棘黃酮粗品,加入X-5樹脂2.0 g,搖勻后旋蒸去除乙醇,將此樹脂加至色譜柱頂層,其上鋪一層脫脂棉。

        完成色譜柱裝填和上樣,將其裝入快速純化制備色譜中。

        1.4.2 黃酮提取物分離純化

        以異鼠李素、槲皮素為參照物,對沙棘黃酮粗品純化的淋洗液可選用甲醇-水(1︰5,V/V)體系。沙棘黃酮類物質(zhì)具有2-苯基色原酮的基本構(gòu)型,在300~400 nm處(Ⅰ帶)、240~285 nm處(Ⅱ帶)具有特定的紫外吸收峰,收集2處吸收峰位置的淋洗液,旋蒸回收溶劑,30 ℃真空干燥,得到純化后的沙棘黃酮Ⅱ[5]。

        1.5 還原性試驗

        配制不同濃度沙棘黃酮粗品Ⅰ、沙棘黃酮Ⅱ、VC(參照物)待測溶液。移取2.5 mL待測液,加入2.5 mL 0.2 mol/L Na3PO4緩沖液(pH 6.6),2.5 mL 1%的K3[Fe(CN)6]溶液,混合液搖勻放入50 ℃烘箱20 min;加入2.5 mL 10%三氯醋酸,離心10 min(800 r/min),取5 mL離心后清液,繼續(xù)加入5 mL超純水和1 mL 0.1%的FeCl3溶液,測定700 nm下吸光度[6]。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 沙棘黃酮類化合物提取

        2.1.1 檢測方法建立

        天然植物提取物成分繁雜,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)選取困難,可根據(jù)沙棘黃酮的主要成分以槲皮素、異鼠李素為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析提取物中總黃酮類化合物含量。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)HPLC譜圖如圖2所示,槲皮素保留時間7.15 min,異鼠李素12.04 min。

        圖2 槲皮素、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖

        2.1.2 均勻設(shè)計試驗

        稀酸溶液與非極性溶劑石油醚對沙棘果渣的脫膠脫脂處理,可減少提取過程溶劑對非黃酮類物質(zhì)的過多溶解,減輕后續(xù)物質(zhì)純化負(fù)擔(dān)。沙棘黃酮類物質(zhì)的2-苯基色原酮結(jié)構(gòu),既有苯環(huán)類疏水非極性基團,又有酚羥基等親水極性基團,因此選擇低碳鏈具有一定極性的無毒、易回收的乙醇為提取溶劑。

        在單因素探索試驗驗證基礎(chǔ)上,選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間為主要影響因素,考慮試驗點的“均勻散布”選用混合水平均勻均勻設(shè)計表U6(32×21)設(shè)計試驗方案,以提取物中總黃酮含量為評價指標(biāo),對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析,明確提取過程的主要影響因素得到最佳提取方案,試驗方案和結(jié)果見表2。

        表2 試驗方案及結(jié)果

        直觀分析法可知,試驗6方法所得提取物中總黃酮含量最高,可將試驗6作為較優(yōu)試驗條件。

        由表3的回歸分析結(jié)果可知,R2為0.991 36,回歸方程非常顯著。對偏回歸系數(shù)進(jìn)行t檢驗時,t值越大,所對應(yīng)系數(shù)越顯著,所以乙醇體積分?jǐn)?shù)是最重要因素。乙醇體積分?jǐn)?shù)的p<0.01,該因素對試驗結(jié)果影響非常顯著;料液比的p在0.01~0.05之間,該因素對試驗結(jié)果影響顯著;提取時間p>0.05,該因素對結(jié)果影響不顯著。根據(jù)偏回歸系數(shù)的正負(fù)可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)升高,增加提取劑體積,延長提取時間,有助于提高指標(biāo)含量,綜合各因素主次和顯著性,最佳方案可設(shè)計為提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,料液比1︰12(g/mL),提取時間1 h。驗證此方案,提取物中總黃酮含量53.05%,如圖3。

        表3 回歸分析結(jié)果

        圖3 驗證試驗提取物HPLC譜圖

        2.1.3 溶劑循環(huán)使用

        提取液通過旋蒸脫除溶劑,溶劑回收循環(huán)進(jìn)行沙棘果渣黃酮索氏提取試驗,溶劑使用次數(shù)與提取物中總黃酮含量如圖4所示,試驗方案采用乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1︰12(g/mL)、提取時間1 h。溶劑隨使用次數(shù)的增多,對黃酮的提取能力逐漸減少,在第5次使用時提取物中總黃酮含量為40.17%,之后快速降低。通過旋蒸回收溶劑,可能會存在低沸點雜質(zhì)與溶劑同時以氣態(tài)形式被冷凝后收集,不利于溶劑作為提取劑循環(huán)使用。溶劑循環(huán)次數(shù)不宜超過4次,使用回收溶劑時,可考慮補加適量新鮮溶劑,保證物質(zhì)的提取效果。

        圖4 溶劑循環(huán)使用與提取物中總黃酮含量關(guān)系

        2.2 沙棘黃酮提取物純化

        混合物質(zhì)的純化,是根據(jù)不同組分的理化性質(zhì)差異,不同組分間在流動相、固定相中的分配系數(shù)、吸附能力、保留時間差異?;旌衔镔|(zhì)在流動相和固定相間不斷重新分配,混合物質(zhì)得到有效分離。制備色譜技術(shù)可應(yīng)用于大規(guī)模純物質(zhì)生產(chǎn),也可用于實驗室級毫克級樣品分離純化。

        2.2.1 快速制備色譜設(shè)置步驟

        接通電源,啟動快速制備色譜;進(jìn)入主界面→[Chemistry]→[Lamp On]→紫外燈預(yù)熱8.0 min;[Solvents]選擇methanol及water的溶劑進(jìn)口;進(jìn)入[Method tab],選擇[New]新建方法或[Open]打開已有方法;進(jìn)入[Parameters]設(shè)置參數(shù),選擇methanol-water溶劑體系,[cartridge]選擇Reverse chromatographic column,[flowrate]設(shè)置默認(rèn)值→[OK];[Collection],選擇ultraviolet detection、wavelength雙波長分別設(shè)置為300~400nm、240~285 nm→[OK];[Collection mode]→[Threshold]→[OK];[Rack Allocation]為默認(rèn)設(shè)置→[OK];[Gradient]界面編輯淋洗劑的洗脫梯度,梯度圖上進(jìn)行拖動修改;保存方法[Save];[Run]運行方法。

        2.2.2 純化過程

        采用快速制備色譜的反向色譜技術(shù)純化沙棘果渣黃酮提取物,將多種黃酮苷與非黃酮類化合物(多糖、蛋白質(zhì)等)分離。反向色譜柱裝填,固定相吸附劑選用X-5型樹脂,流動相淋洗劑選用甲醇-水(1︰5,V/V)體系。紫外檢測器的使用,可提高分離純化效率,節(jié)約淋洗溶劑。沙棘黃酮粗品Ⅰ與淋洗劑在X-5型樹脂上競爭吸附中心,黃酮粗品Ⅰ中不同組分對樹脂吸附能力差異,致使各組分保留時間不同,實現(xiàn)黃酮粗品的純化,黃酮提取物Ⅱ中總黃酮含量如圖5所示,純化后總黃酮含量為71.21%,含量較粗品Ⅰ提高33.60%。天然植物成分復(fù)雜中提取高純的單一產(chǎn)品難度較大。

        圖5 黃酮提取物Ⅱ中總黃酮含量HPLC圖

        2.3 沙棘黃酮提取物活性分析

        天然抗氧化作用是沙棘黃酮提取物的主要生物活性??寡趸饔弥饕獧C制是自由基清除能力,抗氧化組分作為氫供體與制劑自由基反應(yīng)生成惰性化合物,終止鏈?zhǔn)阶杂苫磻?yīng)。理論上,較低的提取溫度有助于提取物生物活性的保留,在乙醇提取黃酮類化合物過程中可能存在活性物質(zhì)的失活,隨提取劑溶出的雜質(zhì)可能會抑制活性組分的抗氧化能力,沙棘黃酮類提取物的抗氧化活性有待進(jìn)一步驗證。

        生化反應(yīng)中,F(xiàn)e3+離子可催化Haber-Weiss反應(yīng)中O2+生成·OH;Cu2+可催化低密度脂蛋白LDL氧化。物質(zhì)還原能力的大小可反應(yīng)其清除自由基能力,黃酮類化合物可絡(luò)合過渡態(tài)的Fe3+、Cu2+等金屬離子,終止其催化氧化自由基反應(yīng)[7],避免體內(nèi)形成過量·OH和其他活性氧自由基,達(dá)到防衰老、抗腫瘤、保護心腦血管的目的。

        圖6 3種物質(zhì)還原能力

        具有還原性的活性物質(zhì)可還原Fe3+成Fe2+,通過顯色反應(yīng)來判斷Fe3+的還原程度,700 nm處的吸光度越高,說明物質(zhì)的還原能力越強。試驗測定VC、純化黃酮Ⅱ和黃酮提取物粗品Ⅰ的還原能力,試驗結(jié)果見圖6。3種物質(zhì)的還原性隨質(zhì)量濃度升高而增長,VC還原能力最高,純化黃酮Ⅱ次之,黃酮粗品Ⅰ的還原能力最低。純化黃酮Ⅱ質(zhì)量濃度0.50 mg/mL時,吸光度達(dá)到0.21,之后隨著質(zhì)量濃度增長,其還原性增長的趨勢平緩。由此推測,黃酮粗品I中所含的雜質(zhì),抑制其抗氧化活性。

        3 結(jié)論

        對沙棘總黃酮的提取、分離純化及還原能力開展試驗研究并取得進(jìn)展。以沙棘果渣為原料,采用索氏抽提方式提取沙棘黃酮類化合物,考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間對總黃酮含量的影響,通過均勻設(shè)計試驗和回歸分析得到,乙醇體積分?jǐn)?shù)對指標(biāo)影響非常顯著、料液比的影響顯著、提取時間果影響不顯著。最佳方案為提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1︰12(g/mL)、提取時間1 h。在此條件下,提取物中總黃酮含量53.05%。從提取物中總黃酮含量分析,提取劑回收循環(huán)利用不易超過4次。Flash快速制備色譜分離純化黃酮類提取物,固定相吸附劑選用X-5型樹脂,流動相淋洗劑選用甲醇-水(1︰5,V/V)體系,純化后總黃酮含量為71.21%,天然植物成分復(fù)雜中提取高純的單一產(chǎn)品難度較大。沙棘黃酮提取物還原能力分析發(fā)現(xiàn),在相同濃度下,純化黃酮Ⅱ的還原能力優(yōu)于黃酮粗品Ⅰ。

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