馬群 馬磊

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，河南 南陽(yáng) 473010）

肺癌是目前世界上最為常見(jiàn)的腫瘤之一，全球每年因肺癌死亡人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)人[1]。在我國(guó)，肺癌發(fā)病率和病死率逐年升高，并居于惡性腫瘤首位。放化療雖能提高患者生存率，但毒副作用嚴(yán)重，輕則損傷患者細(xì)胞免疫功能，導(dǎo)致放化療失敗，增加并發(fā)癥等，嚴(yán)重影響患者生存時(shí)間及生活質(zhì)量[2]。研究顯示，患者免疫功能低下或受抑制時(shí)，肺癌的發(fā)病率明顯增高[3]；同時(shí)體內(nèi)腫瘤進(jìn)行性生長(zhǎng)進(jìn)一步導(dǎo)致患者的免疫功能受抑制，兩者互為因果。研究證實(shí)程序性死亡受體1（Programmed death protein-1，PD-1）及程序性死亡受體配體1（Programmed death ligand-1，PD-L1）可維持和誘導(dǎo)外周組織的免疫耐受，并在病理情況下下調(diào)T細(xì)胞免疫刺激性細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)免疫抑制性細(xì)胞因子分泌，從而抑制T細(xì)胞的免疫反應(yīng)[4]。

本文運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中程序性死亡受體PD-1及其配體PDL1的陽(yáng)性表達(dá)，分析二者與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，為肺癌的免疫治療提供一定的支撐。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2013年1月至2015年1月住院的非小細(xì)胞肺癌手術(shù)患者共85例，收集患者癌組織及癌旁組織（距癌灶＞3 cm以上）石蠟標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次接受手術(shù)治療；未接受化療和放療；患者均知情并簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤疾病的患者；自身免疫性疾病。其中男56例，女29例；年齡42-84歲，平均62.41±6.87歲；鱗癌45例，腺癌30例；組織學(xué)分極，G1期31例，G2期26例，G3期22例；臨床分期：I期19例，II期17例，III期26例，IV期23例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例?；颊呓邮荛T(mén)診或電話(huà)隨訪(fǎng)3～60 m。

1.2 PD-1和PD-L1在癌組織和癌旁組織的表達(dá)

脫蠟4 μm厚的組織切片，以含0.3%過(guò)氧化氫的甲醇溶液封閉15 min，經(jīng)PBS沖洗后，以10%牛血清處理20 min。然后采用PD-1和PD-L1一抗（1：150）4℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗后，將標(biāo)本用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔免疫球蛋白處理30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、鏡檢。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

由兩位病理科醫(yī)師結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度做出判斷。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞＜1%為0分，1%-24%為1分，25%-49%為2分，50-74%為3分，75-100%為4分；染色強(qiáng)度記分：無(wú)染色細(xì)胞為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，兩者相乘≥3分為陽(yáng)性。總積分0-2分：-，3-4分：+，5-8分：++，9-12分：+++。-/+低表達(dá)，++/+++高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1和PD-L1在肺癌組織中的表達(dá)

PD-1主要表達(dá)于細(xì)胞膜，呈淺黃色到棕褐色，見(jiàn)圖1A；85例癌組織中陽(yáng)性表達(dá)69例（81.18%），癌旁組織陽(yáng)性表達(dá)21例（24.71%）。而PD-L1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈淺黃色到棕褐色，見(jiàn)圖1C，85例癌組織中陽(yáng)性表達(dá)70例（82.35%），癌旁組織陽(yáng)性表達(dá)23例（27.06%）。

圖1 PD-1和PD-L1在肺癌組織中的表達(dá)（×200）

2.2 PD-1和PD-L1與肺癌病理、臨床特征的關(guān)系

PD-1和PD-L1蛋白表達(dá)與肺癌的組織分類(lèi)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期相關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.3 PD-1與PD-L1在肺癌中的相關(guān)性分析

在非小細(xì)胞肺癌組織中，PD-1與PD-L1蛋白表達(dá)成正相關(guān)，見(jiàn)表2。

表1 PD-1和PD-L1與肺癌病理、臨床特征的關(guān)系

表2 PD-1與PD-L1在非小細(xì)胞肺癌中的相關(guān)性分析（例）

2.4 PD-1和PD-L1與肺癌患者生存的相關(guān)分析

在非小細(xì)胞肺癌中組織中，PD-1和PD-L1蛋白高表達(dá)患者總生存明顯低于低表達(dá)患者（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)

2.5 多因素Cox回歸分析

Cox逐步多因素分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、PD-1和PD-L1均是非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響指標(biāo)。

3 討論

腫瘤免疫逃逸是腫瘤生存的重要策略。腫瘤免疫逃逸的機(jī)制很多，包括免疫抑制，這已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。PD-L1/PD-1信號(hào)通路是腫瘤免疫抑制的重要組成部分，可以抑制T淋巴細(xì)胞的活化并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受性，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸[5]。

PD-1屬于CD28家族成員，由268個(gè)氨基酸構(gòu)成，在多種免疫細(xì)胞表面均有表達(dá)。PD-1結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，其胞內(nèi)區(qū)尾部的C端和N端含有兩個(gè)獨(dú)立的位點(diǎn)[6]。PD-L1和PDL2是目前已被證實(shí)的PD-1的兩個(gè)配體，研究發(fā)現(xiàn)活化后的T細(xì)胞能釋放細(xì)胞因子使PD-L1上調(diào)，而上調(diào)后的PD-L1會(huì)與PD-1結(jié)合抑制T細(xì)胞導(dǎo)致其凋亡，減輕T細(xì)胞對(duì)周?chē)M織損傷[7]。另一方面，磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（Signal transduction and activators of transcripttion 3，STAT）等信號(hào)通路可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生PD-L1，與受體結(jié)合抑制T細(xì)胞活性，使得腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)免疫逃逸[8]。

表2 多因素Cox回歸分析

本研究發(fā)現(xiàn)，PD-1、PD-L1蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁肺組織，且與肺癌的組織分類(lèi)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期相關(guān)。其中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者肺癌組織PD-1、PD-L1蛋白水平相對(duì)增加，并伴隨組織學(xué)分級(jí)、臨床分期增加而增加，提示PD-1、PD-L1與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、進(jìn)展關(guān)系密切，是輔助診斷非小細(xì)胞肺癌的的有效的腫瘤標(biāo)記物。隨訪(fǎng)結(jié)果提示，PD-1、PD-L1蛋白高表達(dá)患者與低表達(dá)患者相比總生存較差，說(shuō)明PD-1、PD-L1蛋白是較好的診斷非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的指標(biāo)，這與其他組織腫瘤的預(yù)后比較類(lèi)似。PD-L1和PD-1的表達(dá)均與非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤細(xì)胞侵襲性腫瘤生物學(xué)特征相關(guān)，基質(zhì)PD-1表達(dá)與基質(zhì)PD-L1染色以及腫瘤內(nèi)和基質(zhì)CD8表達(dá)均顯著相關(guān)[9]，基質(zhì)PD-1 / PD-L1的表達(dá)可能是非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后指標(biāo)?？梢?jiàn)，PD-1、PD-L1是潛在的治療非小細(xì)胞肺癌的靶點(diǎn)。

同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織PD-1蛋白水平與PD-L1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、PD1和PDL1均是非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響指標(biāo)，其原因可能是PD-L1基因可通過(guò)與腫瘤細(xì)胞PD1結(jié)合，降低機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[10]。

綜上所述，PD-1、PD-L1有望成為非小細(xì)胞肺癌治療中一種新的預(yù)后工具和生物標(biāo)記物。