崔松體 左坦坦 李照義

骨肉瘤是一種好發(fā)于兒童和青少年的骨科惡性腫瘤，總體發(fā)病率約為4.4/10萬人，近年來發(fā)病率呈增加狀態(tài)。骨肉瘤的發(fā)病與長骨干的第二生長高峰期密切相關(guān)，其中股骨遠(yuǎn)端、脛骨和肱骨近端較為多見[1-3]。近年來隨著化療技術(shù)的不斷進(jìn)步，骨肉瘤患者預(yù)后有了很大的改善，但由于骨肉瘤組織易發(fā)生轉(zhuǎn)移進(jìn)而侵襲其它臟器，對患者預(yù)后產(chǎn)生不良影響，因此通過對其免疫機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)掘新興靶點，對于疾病的診斷、治療及預(yù)后具有重要的意義[4-5]。細(xì)胞周期數(shù)依賴性蛋白激酶(cell cycle number dependent protein kinase，CDKs)是機(jī)體細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因子，研究發(fā)現(xiàn)其家族成員CDK4、CDK6對于多種惡性腫瘤的病情判斷及預(yù)后具有指示價值，美國FDA已批準(zhǔn)將CDK4/6用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的臨床治療[5-6]。CD133是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面標(biāo)志物，通過作用于多種細(xì)胞如小腸干細(xì)胞、人腎上皮細(xì)胞、結(jié)直腸癌、前列腺癌等組織細(xì)胞發(fā)揮生物標(biāo)志物功能[7-8]。在骨肉瘤組織中CDK4、CD133表達(dá)改變及其臨床價值尚不明確，本研究對本院收治的骨肉瘤患者組織中CDK4、CD133表達(dá)進(jìn)行探討，旨在為其免疫學(xué)機(jī)制研究及靶向藥物開發(fā)提供有價值的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集本院骨科2013年3月至2015年3月進(jìn)行手術(shù)的骨肉瘤患者87例，在術(shù)中收集其病灶標(biāo)本，保存于液氮中備用。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)術(shù)中病理證實為骨肉瘤。②術(shù)前未接受放、化療或免疫治療。③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其它惡性腫瘤。②治療中途轉(zhuǎn)院。③對研究不配合。87例骨肉瘤患者中男性56例，女性31例；年齡7～49歲，平均(21.98±7.94)歲；發(fā)病部位：股骨41例，脛骨32例，肱骨14例；Enneking外科分期Ⅰ期28例，Ⅱ期32例，Ⅲ期27例；組織學(xué)類型普通型51例、毛細(xì)血管擴(kuò)張型19例，小細(xì)胞型17例；按是否轉(zhuǎn)移：有肺轉(zhuǎn)移28例，無肺轉(zhuǎn)移59例。選擇同期醫(yī)院骨科進(jìn)行手術(shù)的骨軟骨瘤手術(shù)切除標(biāo)本作為對照，對照組包括男性28例，女性12例，年齡11～42歲，平均(23.36±6.75)歲。2組性別、年齡比較無差異(P>0.05)。本研究征得醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 免疫組化檢測

采用免疫組化SP法檢測2組患者病灶組織中CDK4、CD133蛋白表達(dá)情況，具體步驟：將石蠟包埋的組織進(jìn)行4 μm切片，切片浸泡于PH 8.0的EDTA溶液中，微波抗原修復(fù)10 min，冷卻至室溫后充分將其水洗，并用PBS進(jìn)行浸洗，加入山羊血清封閉液孵育20 min，去除多余的液體。滴加CDK4、CD133單抗后4 ℃過夜孵育，PBS洗后加入具有生物標(biāo)記的二抗37 ℃孵育30 min，采用DAB試劑盒進(jìn)行顯色，并以蘇木精染色，中性樹膠封片后鏡檢結(jié)果。由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲評閱，以胞核或胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，采用半定量法計算其陽性率。

1.3 隨訪

所有患者均在術(shù)后復(fù)查時或電話進(jìn)行隨訪，隨訪間隔為3個月，總生存時間(OS)：自術(shù)后出院第1天開始，至患者死亡或隨訪截止時間，隨訪截至?xí)r間為2020年5月1日。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 2組組織中CDK4、CD133表達(dá)陽性率比較

研究組病灶組織中CDK4、CD133蛋白表達(dá)陽性率高于對照組(P>0.05)，見表1。

表1 2組組織中CDK4、CD133陽性表達(dá)比較(例，%)

2.2 骨肉瘤組織CDK4、CD133表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

骨肉瘤組織CDK4、CD133表達(dá)與外科分期、是否轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、發(fā)病部位及組織學(xué)類型無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 骨肉瘤組織CDK4、CD133表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

2.3 骨肉瘤組織CDK4、CD133表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

Logrank分析結(jié)果顯示，骨肉瘤組織CDK4、CD133陽性表達(dá)表達(dá)患者OS分別為26.0月、28.0月，低于CDK4、CD133陰性骨肉瘤患者OS的36.0個月、39.0個月(P<0.05)，見圖1。

圖1 骨肉瘤組織CDK4、CD133表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

骨肉瘤是以危害青少年及兒童為主、異質(zhì)性高的惡性腫瘤，因其在診斷時20%已處于晚期階段或發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，臨床死亡率較高[9-10]。骨肉瘤在臨床上分型較多，治療相對棘手，近年來以PD-1/PD-L1抑制劑為代表的免疫靶向治療在多種惡性腫瘤治療中取得了較好的進(jìn)展，但由于骨肉瘤機(jī)制研究尚少[11-12]，相關(guān)靶點發(fā)掘不足，因此臨床中可用于該病的治療藥物相對較少，通過發(fā)掘可靠的生物標(biāo)志物對該病的免疫機(jī)制進(jìn)行了解，對于指導(dǎo)患者個體化治療，改善患者的預(yù)后具有重要價值。

既往研究發(fā)現(xiàn)，胞外信號可通過CDK4/CDK6途徑影響細(xì)胞周期過程，進(jìn)而通過磷酸化反應(yīng)形成CyclinE-CDK2復(fù)合物，促使細(xì)胞反應(yīng)通過R點，進(jìn)入細(xì)胞分裂期，而腫瘤細(xì)胞由于Cyclin D1蛋白過表達(dá)，正常的CDK4/6細(xì)胞增殖途徑失控，導(dǎo)致其無限增殖，因此抑制CDK4/6途徑是抗腫瘤的重要機(jī)制之一[13-14]。臨床研究發(fā)現(xiàn)CDK4/6抑制劑單藥或聯(lián)合化療藥物對于晚期乳腺癌起到了延長無進(jìn)展生存期和總生存期的作用[15-16]。CD133最初作為造血祖細(xì)胞的特異性標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，后又被證明可用于分離鑒定腫瘤干細(xì)胞，是1種新興的細(xì)胞表面標(biāo)志物分子[17-18]，在腫瘤方面，研究發(fā)現(xiàn)，CD133在卵巢組織中表達(dá)上調(diào)與卵巢癌預(yù)后不良有關(guān)，而靶向CD133的溶瘤腺病毒可選擇性感染CD133_結(jié)直腸癌細(xì)胞，表現(xiàn)出一定的靶向治療潛力，對于預(yù)測結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有一定的價值[19]。本研究通過免疫組化法研究了骨肉瘤組織及骨軟骨瘤組織中CDK4、CD133蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示CDK4、CD133蛋白在骨肉瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)，與洪峰、Zhou等[20-21]報道結(jié)果一致，證明了CDK4、CD133蛋白可能參與了骨肉瘤的發(fā)病過程。本研究進(jìn)一步探討了CDK4、CD133蛋白與骨肉瘤患者臨床參數(shù)的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示CDK4、CD133蛋白在外科分期為Ⅲ期及發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的患者中陽性率明顯較高，說明CDK4、CD133可能參與了骨肉瘤的病理進(jìn)展及肺轉(zhuǎn)移過程，因此，通過檢測CDK4、CD133對于判斷骨肉瘤分期及肺轉(zhuǎn)移具有一定的價值，但CDK4、CD133蛋白與其它臨床參數(shù)之間的聯(lián)系在本研究中未體現(xiàn)，有待進(jìn)一步的研究。為了探討CDK4、CD133蛋白在骨肉瘤患者預(yù)后中的價值，本研究采用Logrank法比較了CDK4、CD133不同表達(dá)患者的OS，結(jié)果顯示CDK4陽性、CD133陽性骨肉瘤患者OS均顯著低于CDK4陰性、CD133陰性的患者，證明CDK4、CD133對于判斷患者預(yù)后具有一定的價值。

綜上所述，本研究結(jié)果證明了CDK4及CD133蛋白在骨肉瘤組織中表達(dá)增加，與外科分期、肺轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后有關(guān)，但由于樣本量較少且未進(jìn)行體外研究等缺點，CDK4及CD133蛋白用于骨肉瘤患者臨床診斷、治療及預(yù)后判斷中的價值及其發(fā)揮作用的機(jī)制有待更進(jìn)一步的研究完善。