方 玲 夏永欣 田春陽

胃癌是臨床上最常見的消化道腫瘤之一，當(dāng)前胃癌每年新發(fā)病例在百萬人左右，而有效的早期檢測診斷方法缺乏，致使很多患者在確診時(shí)就已處于晚期，失去了根治性手術(shù)的可能，因此死亡率一直居高不下[1-2]。胃癌的發(fā)生機(jī)制還不明確，不過可能是先天性與后天性因素共同作用的結(jié)果，包括幽門螺桿菌感染、吸煙、肺炎、體細(xì)胞突變、基因擴(kuò)增和缺失、基因失活和異常DNA甲基化、不良飲食習(xí)慣等[3-4]。而尋找胃癌發(fā)生的診斷標(biāo)志物及探討胃癌發(fā)生的分子機(jī)制，對(duì)早期預(yù)防胃癌具有重要的價(jià)值[5]。DOK蛋白家族包括DOK1、DOK2、DOK3、DOK4等，都擁有DOK家族類似結(jié)構(gòu)，含有多個(gè)酪氨酸蛋白激酶位點(diǎn)[6]。DOK3和DOK2為受體酪氨酸激酶和非受體酪氨酸激酶信號(hào)通路的常見底物，包括表皮生長因子受體、血小板源生長因子受體等。DOK3和DOK2的過度表達(dá)可負(fù)性調(diào)節(jié)ERK4、MYC等因素，從而參與細(xì)胞增殖、凋亡、生長和遷移等多種過程[7-8]。最近研究表明DOK蛋白為腫瘤抑制因子，可以抑制惡性腫瘤的發(fā)生[9-10]。本文具體探討了DOK3和DOK2的表達(dá)在早期胃癌診斷及與其病理變化中的意義，希望為胃癌的臨床診治干預(yù)策略提供生物學(xué)基礎(chǔ)。現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且所有患者都自愿簽署了知情同意書。將2017年1月至2020年6月在本院診治的早期胃癌80例作為胃癌組，同期選擇在本院診治的胃癌前病變患者80例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)診斷為胃癌或胃癌前病變；年齡30～80歲；所有患者在獲取標(biāo)本前未接受治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠與哺乳期婦女；伴有其他部位惡性腫瘤者；全身感染性疾病者；臨床與檢測資料缺乏者。

對(duì)照組男性42例，女性38例；年齡32～78歲，平均年齡(48.02±5.22)歲；疾病類型：慢性淺表性胃炎29例，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變31例，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變20例。胃癌組男性45例，女性35例；年齡30～80歲，平均年齡(48.94±4.44)歲；臨床分期：Ⅰ期50例，Ⅱ期30例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例；組織學(xué)分化：高分化42例，中分化18例，低分化20例；病灶直徑≥4 cm 40例，病灶直徑<4 cm 40例。2組患者的性別、年齡等對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 血清學(xué)檢測

采集所有患者的空腹外周靜脈血3～5 ml，室溫條件下待外周血自然凝固(30 min左右)后離心5 min(1 000 rpm/min)，取上層血清在-80 ℃冰箱保存。提取血液的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，內(nèi)參照為U6，引物由上海生工公司合成。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士羅氏診斷公司)檢測與計(jì)算DOK3和DOK2相對(duì)表達(dá)水平。上述檢測qPCR檢測試劑盒均購買于上海吉碼公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑購自日本TaKaRa公司，DOK3引物(5'-TCAGCGGATATA-ATACAACCTGC-3'，5'-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTCAC-3')，DOK2引物(5'-ATTGGAACGAIACAGAGAAGATG-3'，5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3')。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差等表示，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以百分比表示，選擇SPSS 19.00軟件進(jìn)行統(tǒng)一分析，計(jì)量數(shù)據(jù)對(duì)比采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)對(duì)比采用卡方分析，分析生存曲線通過Kaplan Meier方法與log-rank檢驗(yàn)生成，相關(guān)性分析采用Pearson分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血清DOK3和DOK2表達(dá)水平對(duì)比

胃癌組中的血清DOK3和DOK2相對(duì)表達(dá)水平都顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 2組血清DOK3和DOK2相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比

2.2 DOK3、DOK2的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性

在胃癌組中，不同組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病灶直徑的血清DOK3和DOK2表達(dá)水平對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 早期不同病理特征胃癌患者血清DOK3和DOK2表達(dá)對(duì)比

2.3 相關(guān)性分析

在胃癌組中，Pearson分析顯示血清DOK3、DOK2表達(dá)與組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病灶直徑都存在相關(guān)性(P<0.05)。見表3。

表3 早期胃癌患者血清DOK3、DOK2表達(dá)與病理特征的相關(guān)性(n=80)

2.4 預(yù)后情況

所有胃癌患者隨訪2020年8月，生存64例，死亡16例，死亡率為20.0%。死亡患者的血清DOK3和DOK2表達(dá)水平顯著低于生存患者(P<0.05)。見表4。

表4 早期胃癌不同預(yù)后患者的血清DOK3和DOK2表達(dá)對(duì)比

3 討論

胃癌是最常見的癌癥之一，主要分布在亞洲、歐洲與美洲等地區(qū)，早期胃癌的診斷率低于10%，不能進(jìn)行根治性手術(shù)切除，因此死亡率一直居高不下。已有研究顯示胃癌的惡性進(jìn)展速度已經(jīng)超過治療的治愈速度，從而嚴(yán)重影響患者的身心健康[10]。胃癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的、多階段、多因素相關(guān)的事件，也是一個(gè)胃炎-腸上皮化生-低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變-高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的連續(xù)過程[11]。DOK3和DOK2都為一種接頭蛋白，參與負(fù)反饋調(diào)節(jié)酪氨酸激酶受體介導(dǎo)的信號(hào)傳遞[12]。抑制DOK3和DOK2的表達(dá)均可以促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生，提示它們?yōu)閻盒阅[瘤的抑癌基因[13]。本研究顯示胃癌組中的血清DOK3和DOK2相對(duì)表達(dá)水平都顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，表明胃癌患者多伴隨有血清DOK3和DOK2的低表達(dá)。從機(jī)制上分析，DOK2和DOK3是關(guān)鍵酪氨酸激酶的底物，兩者都可以下調(diào)人巨噬細(xì)胞集落刺激因子刺激的巨噬細(xì)胞反應(yīng)，可以抑制PTK介導(dǎo)的致癌信號(hào)[14]。

胃癌的增殖、分化與轉(zhuǎn)移是1個(gè)多步驟的生物級(jí)聯(lián)的過程，尤其是癌基因的活化和抑癌基因的失活起著重要作用。胃癌早期主要轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)、肝臟、腹膜等部位，通過直接侵入或通過血液、淋巴系統(tǒng)等途徑進(jìn)行更遠(yuǎn)距離的播種[15]。DOK家族的成員都具有典型的結(jié)構(gòu)特征：N端的PH結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)將蛋白定位到細(xì)胞膜上；中間的磷酸化酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)DOK家族蛋白與磷酸化酪氨酸的結(jié)合；C端序列富含脯氨酸，可作為活化的蛋白酪氨酸激酶誘導(dǎo)的信號(hào)復(fù)合物組裝的平臺(tái)[16]。本研究顯示不同組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病灶直徑胃癌患者的血清DOK3和DOK2表達(dá)水平對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Pearson分析顯示胃癌患者的血清DOK3、DOK2表達(dá)與組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病灶直徑都存在相關(guān)性(P<0.05)。當(dāng)前也有研究顯示DOK3在低級(jí)別的消化道炎癥病變中呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，而在消化道惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)狀況[17]。

胃癌的過渡增殖伴隨有一些生長因子的過度表達(dá)，生長因子與受體結(jié)合觸發(fā)位于胞膜上的受體形成二聚復(fù)合物，過度活化胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶，下游信號(hào)途徑中關(guān)鍵蛋白元件受到持續(xù)激活，引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[18-19]。本研究顯示在胃癌組中，死亡患者的血清DOK3和DOK2表達(dá)水平顯著低于生存患者(P<0.05)。從機(jī)制上分析，DOK3和DOK2表達(dá)下降可能提高胃癌上皮細(xì)胞的粘附能力與浸潤能力，促進(jìn)胃癌患者的病變進(jìn)展，從而使得患者的死亡率上升[20-21]。本研究也有一定的不足，樣本數(shù)量較少，且隨訪時(shí)間比較短，將在后續(xù)研究中深入探討。

總之，早期胃癌患者血清DOK3和DOK2水平均顯著降低，且該兩個(gè)指標(biāo)與患者的病理特征存在相關(guān)性，也可作為預(yù)測預(yù)后的有效標(biāo)志物。