馮垚 張洪淞 李?lèi)?ài)歆 劉擎

(1佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154000；2佳木斯市中心醫(yī)院)

肺動(dòng)脈高壓(PAH)是指肺血管阻力進(jìn)行性增高的一類(lèi)疾病，嚴(yán)重影響原發(fā)性心肺疾病患者的預(yù)后，最終可導(dǎo)致患者右心衰竭而死亡。近年來(lái)有關(guān)PAH發(fā)病機(jī)制及治療的研究已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，血管重構(gòu)(VR)和新生、血管和組織間多種炎性因子浸潤(rùn)所致的炎癥性改變及原位血栓的形成是PAH的主要病理學(xué)改變。其中血管重構(gòu)被認(rèn)為是造成血管病變及循環(huán)功能紊亂的主要病理學(xué)基礎(chǔ)〔1〕。PAH的VR首先是從構(gòu)成血管內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞(EC)功能障礙開(kāi)始。EC可分泌多種參與調(diào)節(jié)血管收縮及舒張、纖維溶解等過(guò)程的生物活性物質(zhì)，故其受損后可出現(xiàn)血管舒縮障礙、肺小動(dòng)脈管腔縮小、平滑肌細(xì)胞增生、內(nèi)膜增厚等典型的病理學(xué)改變。而PAH過(guò)程中血管新生的活躍也是EC凋亡被抑制的一種體現(xiàn)〔2〕。研究顯示，特發(fā)性PAH(IPAH)患者的肺部血管病灶中可檢測(cè)到巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，且患者血清中亦可檢測(cè)到多種前炎性細(xì)胞因子和炎性標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)，包括白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、可溶性P選擇素(sP-Sel)和可溶性細(xì)胞間黏附因子(sICAM)-1等〔3〕。可見(jiàn)炎癥反應(yīng)在PAH的發(fā)生和演進(jìn)中扮演重要角色，研究PAH的炎癥過(guò)程可能成為尋求有效治療該病的新靶點(diǎn)。IL-8是由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞表達(dá)的一種重要的中性粒細(xì)胞趨化因子，其可通過(guò)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒而促使血管EC上調(diào)表達(dá)和分泌IL-8，IL-8進(jìn)而在血管的炎性循環(huán)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Koch等〔4〕在硫化氫對(duì)PAH大鼠血管炎癥作用的研究中發(fā)現(xiàn)，PAH模型組IL-8含量要明顯高于對(duì)照組，這表明IL-8在PAH的炎性反應(yīng)中具有一定的作用。野百合堿(MCT)可在肝臟中代謝成為吡咯MCT，后者進(jìn)而經(jīng)過(guò)一系列病理生理過(guò)程而使血管內(nèi)皮損傷、平滑肌細(xì)胞增生和肺血管重構(gòu)。由于MCT可轉(zhuǎn)變?yōu)榭墒寡芷琳瞎δ苁軗p的吡咯MCT，故其已被廣泛應(yīng)用以制備經(jīng)典的PAH動(dòng)物模型〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織中參與炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的核因子(NF)-κB mRNA表達(dá)升高，說(shuō)明炎癥反應(yīng)在MCT致PAH發(fā)生和發(fā)展中起重要作用〔6〕。

目前臨床上治療PAH的藥物主要包括前列腺素類(lèi)、磷酸二酯酶抑制劑和內(nèi)皮素受體拮抗劑等，雖然這些藥物可在一定程度上治療PAH和改善心功能，但有關(guān)各類(lèi)藥物的有效性和安全性還需經(jīng)臨床實(shí)踐進(jìn)一步驗(yàn)證。作為3-羥基3-甲基戊二酰輔酶(HMG-Co)A還原酶抑制劑，他汀類(lèi)藥物目前以其獨(dú)立于降脂作用之外的多效性作用被廣泛應(yīng)用于臨床，這包括其被用于改善血管內(nèi)皮功能、治療動(dòng)脈硬化、抑制炎癥反應(yīng)、改善凝血功能和抑制平滑肌細(xì)胞增殖等。臨床研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可加速冠狀動(dòng)脈手術(shù)患者中性粒細(xì)胞的凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，并可改善PAH患者的右心收縮壓升高、6 min步行距離試驗(yàn)縮短和心輸出量降低〔7〕。在他汀類(lèi)藥物中，阿托伐他汀屬第3代產(chǎn)品，其臨床效用和抗炎作用明顯強(qiáng)于比辛伐他汀和氟伐他汀。本研究通過(guò)MCT構(gòu)建炎癥性PAH大鼠模型，并應(yīng)用阿托伐他汀干預(yù)來(lái)研究其對(duì)模型大鼠PAH、右心室肥大指數(shù)和血清IL-8含量的影響，初步探討阿托伐他汀治療PAH的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1溶液及藥品配制 ①0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖溶液(pH6.0)：稱(chēng)取3.0 g枸櫞酸三鈉和0.4 g枸櫞酸，將二者加入1 000 ml雙蒸水中，磁力攪拌使其分溶解。② 蘇木素染液：稱(chēng)取2.5 g蘇木素加入25 ml無(wú)水乙醇中，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓环Q(chēng)取22 g硫酸鋁鉀加入到500 ml雙蒸水中，加熱使其充分溶解；將蘇木素-乙醇溶液加入硫酸鋁鉀溶液中，并盡快加熱至沸騰；迅速移離熱源，攪拌溶液直至溫度降至90℃左右；稱(chēng)取1.25 g一氧化汞，緩慢加入溶液中，攪拌溶液直至一氧化汞完全溶解；迅速將溶液置于冷水中靜置；次日過(guò)濾后密閉儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?12.5 mg/ml MCT溶液：將MCT加入適量的20%乙醇中，攪拌使其充分溶解；加入一定量生理鹽水至MCT濃度為12.5 mg/ml。④1 mg/ml阿托伐他汀溶液：將20 mg阿托伐他汀用研磨器研碎，并加入20 ml生理鹽水中充分混合溶解，制備成1 mg/ml 阿托伐他汀溶液。

1.2PAH大鼠模型的建立及動(dòng)物分組 選取體重200～220 g的雄性SD大鼠24只，在恒溫(21±1)℃、明暗交替(12 h/d)和相對(duì)濕度為(50±5)%條件下自由攝食水飼養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為PAH模型組、阿托伐他汀組和對(duì)照組各8只。PAH模型組和阿托伐他汀組按60 mg/kg腹部皮下一次性注射MCT溶液，對(duì)照組則注射等量的生理鹽水。自腹腔注射之日起，阿托伐他汀組按10 mg/kg灌胃給予阿托伐他汀溶液，PAH模型組和對(duì)照組則灌胃給予等量的生理鹽水。各組均每日灌胃1次，持續(xù)3 w。實(shí)驗(yàn)中共2只大鼠死亡，均屬于PAH模型組，分別死于實(shí)驗(yàn)中的第17天和第21天，呼吸困難為大鼠死亡前的主要表現(xiàn)。

1.3記錄各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況及生存情況

1.4血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 按孫波等〔8〕報(bào)道的方法進(jìn)行操作，具體如下：將外徑為1 mm、具有刻度的10 cm長(zhǎng)右心軟管預(yù)充肝素鈉，并用三通管與換能器連接備用；用10%的水合氯醛按300 mg/kg對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉注射；待固定麻醉大鼠后，手術(shù)暴露剝離右側(cè)頸外靜脈和頸總靜脈，并進(jìn)行右心插管；將導(dǎo)管經(jīng)換能器與數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)連接，利用系統(tǒng)軟件測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓(MPAP)。

1.5右心室肥厚指數(shù)檢測(cè) 用手術(shù)剪沿房室溝將心房和大血管根部剪掉，然后再沿后室壁間溝切下右心室；吸水紙吸取殘留血液后，對(duì)右心室游離壁(RV)和左心室+室間隔(LV+S)進(jìn)行稱(chēng)重；利用公式計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(RVHI)，RVHI= RV/(LV+S)。

1.6肺組織蘇木素-伊紅染色及計(jì)算肺小動(dòng)脈管壁厚度占血管外徑的百分比(WT%)和肺動(dòng)脈管壁面積占血管總面積的百分比(WA%) 切取右肺中葉組織，進(jìn)行常規(guī)甲醛固定和石蠟包埋；沿右肺門(mén)水平橫向行厚度為 5 μm的切片，然后將切片行蘇木素-伊紅(HE)染色；在光鏡下評(píng)估肺小動(dòng)脈病變情況；按Barth等〔9〕報(bào)道的方法測(cè)算各組實(shí)驗(yàn)肺組織的肺動(dòng)脈直徑，將直徑為50～150 μm的血管設(shè)定為目標(biāo)血管；不間斷地分別測(cè)算10個(gè)目標(biāo)血管的血管總面積(TA)、血管腔面積(VA)、管壁厚度(WT)和血管外徑(ED)。分別利用以下公式計(jì)算WT%和WA%；WT%=(2×WT/ED)×100%，WA%=(TA-VA)/TA×100%。

1.7血清中IL-8含量的檢測(cè) 利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)大鼠血清IL-8含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般狀態(tài)與存活情況 對(duì)照組及阿托伐他汀組體毛順滑富有光澤，行動(dòng)靈活、反應(yīng)敏捷，飲食正常，PAH模型組體毛暗淡少光澤，萎靡不振、反應(yīng)遲鈍，飲食量減少。

2.2各組血流動(dòng)力學(xué)及右心室肥厚指數(shù)、WT%、WA%、IL-8含量 與對(duì)照組比較，PAH模型組和阿托伐他汀組MPAP和RVHI、WT%、WA%、IL-8含量均顯著增高(均P<0.05)；與PAH模型組比較，阿托伐他汀組MPAP和RVHI、WT%、WA%、IL-8含量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

組別nMPAP(mmHg)RVHIWT%WA%IL-8(ng/ml)對(duì)照組815.11±0.7124.93±4.6520.82±4.8330.63±4.7613.65±1.13PAH模型組623.61±2.011)32.87±2.11)38.66±5.481)56.18±6.51)61.21±5.421)阿托伐他汀組820.43±1.341)2)26.65±1.71)2)21.43±4.31)2)37.08±3.81)2)29.36±4.451)2)

2.3各組肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變 對(duì)照組肺小動(dòng)脈的管壁厚度均一，管腔中見(jiàn)有連續(xù)完整的內(nèi)皮細(xì)胞，且僅有少量結(jié)締組織見(jiàn)于血管周?chē)籔AH模型組肺小動(dòng)脈可見(jiàn)管壁增厚和管腔縮小，內(nèi)皮細(xì)胞間的連續(xù)性出現(xiàn)斷裂且不完整，有大量的結(jié)締組織見(jiàn)于血管周?chē)?，且管壁可?jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；阿托伐他汀組肺小動(dòng)脈管壁厚度較均一，僅見(jiàn)輕度管壁增厚和管腔縮小。見(jiàn)圖1。

圖1 各組肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變(×400)

2.4IL-8含量與MPAP、肺小動(dòng)脈WT%和WA%的相關(guān)性 IL-8含量與MPAP、肺小動(dòng)脈WT%和WA%呈明顯正相關(guān)(r=0.82、0.87、0.64，均P<0.05)。

3 討 論

即便PAH臨床類(lèi)型眾多，但各類(lèi)型病理生理學(xué)的最顯著特點(diǎn)均是血管性炎癥及血管重構(gòu)引起的PAH的進(jìn)行性惡化，進(jìn)而導(dǎo)致右心衰竭乃至全心衰竭，甚至死亡。迄今為止，臨床治療PAH的效果不佳，且經(jīng)常出現(xiàn)不同的不良反應(yīng)。多種因素如缺血缺氧、局部微血栓的形成、血管收縮和舒張因子失衡及炎癥等均可引起PAH發(fā)生復(fù)雜性血管病變。本文MCT誘導(dǎo)大鼠PAH模型的成功構(gòu)建與先前的研究成果相符〔10〕，確認(rèn)了MCT可通過(guò)作用于肺動(dòng)脈系統(tǒng)，導(dǎo)致出現(xiàn)肺動(dòng)脈EC損傷、平滑肌細(xì)胞增殖和肺間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)改變，引發(fā)炎癥性PAH。本研究說(shuō)明阿托伐他汀能在一定程度上降低肺動(dòng)脈壓力，這與Souza-Costa等〔11〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

研究表明PAH造成肺血管新生及重建，由于血管新生可致血管阻力增大，進(jìn)而加重組織缺血缺氧，而在缺血缺氧條件下，組織為了代償又會(huì)增加血管新生，由此產(chǎn)生血管新生和組織缺血缺氧之間的惡性循環(huán)，進(jìn)一步加重了肺動(dòng)脈重構(gòu)和PAH。Simonini等〔12〕研究顯示，當(dāng)抑制PAH大鼠的血管新生后，可減少大鼠的肺動(dòng)脈重建，其PAH亦有所改善。本研究表明應(yīng)用MCT可導(dǎo)致大鼠發(fā)生肺血管重建；而當(dāng)應(yīng)用阿托伐他汀干預(yù)后肺小動(dòng)脈WT%和WA%顯著減小，提示阿托伐他汀可抑制血管新生，改善肺血管重構(gòu)。

IL-8是目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)中性粒細(xì)胞趨化活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子。研究證實(shí)腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β等在炎癥反應(yīng)中的作用很大程度上是通過(guò)誘導(dǎo)IL-8來(lái)介導(dǎo)完成的。MCT造成肺血管內(nèi)皮損傷后各種因子進(jìn)入血管平滑肌中層，刺激IL-8的分泌和表達(dá)〔13〕。IL-8通過(guò)刺激平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖而導(dǎo)致中膜肥厚，并出現(xiàn)肺血管重建。PAH和缺血缺氧狀態(tài)可使骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員出來(lái)，并向損傷部位歸巢〔14〕。IL-8可誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞發(fā)生遷移和增殖，促進(jìn)新生血管形成〔15〕。但因?yàn)樾律茏甜B(yǎng)管具有易碎性和滲出性，故其可加速平滑肌細(xì)胞增殖，進(jìn)一步促進(jìn)肺血管重建，進(jìn)而使PAH病情加重和惡化。本研究提示IL-8可參與PAH進(jìn)程，且在肺血管新生及重建中發(fā)揮顯著作用；阿托伐他汀可通過(guò)降低IL-8的分泌，即抗炎途徑對(duì)PAH起到一定治療作用；通過(guò)降低IL-8的表達(dá)減輕血管重建、抑制血管新生可能進(jìn)一步起到延緩PAH的作用，這與陳建英等〔16〕研究結(jié)果一致。

研究表明，在PAH發(fā)展早期和整個(gè)治療過(guò)程中他汀類(lèi)藥物可經(jīng)抗炎作用而治療PAH〔17〕。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀能降低脂多糖誘導(dǎo)的人肺上皮細(xì)胞IL-6等炎癥因子分泌，表明阿托伐他汀可對(duì)人肺細(xì)胞發(fā)揮直接抗炎作用，但其機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可抑制IL-8的分泌來(lái)減輕PAH，考慮可能的機(jī)制為抑制調(diào)節(jié)免疫炎癥相關(guān)基因的重要轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活和活性亞基P50的釋放，使其與DNA結(jié)合能力降低，減少I(mǎi)L-8的產(chǎn)生和分泌，抑制炎癥反應(yīng)。Farooq等〔18〕發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)可通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)P38絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路來(lái)減輕人EC的炎癥反應(yīng)，而P38MAPK可介導(dǎo)人肺血管EC上包括IL-8、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1在內(nèi)的趨化因子和黏附分子的表達(dá)。他汀類(lèi)可下調(diào)MCT誘導(dǎo)PAH大鼠模型的細(xì)胞癌基因c-fos、TNF-α等表達(dá)，從而降低對(duì)IL-8的誘導(dǎo)作用。

綜上，阿托伐他汀能減輕MCT誘導(dǎo)的肺部炎癥，降低MPAP和抑制右心室肥厚，可降低模型大鼠血清IL-8水平，提示其可能經(jīng)下調(diào)IL-8表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗炎和抑制血管重構(gòu)功能。然而，有關(guān)阿托伐他汀治療PAH是否存在劑量依賴(lài)性、具體通過(guò)何途徑降低IL-8的表達(dá)仍需要深入研究。