朱秋花，潘學誼，曾文彬，周蘭蘭，關則兵

(廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院血液內科，廣州 510080)

初診的急性髓系白血病(AML)患者中有30%～40%可伴有髓外浸潤(EMI)，EMI主要表現(xiàn)為淋巴結腫大、皮膚結節(jié)、齒齦增生、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵犯及肝脾腫大等[1]。急性早幼粒細胞白血病(APL)占成人AML的10%～15%，具有特殊的生物學和遺傳學特征。APL常起病較兇險，有10%～20%的患者死于早期出血。EMI在APL中發(fā)生不少見，且研究顯示EMI與AML患者預后差相關[2]。作為多梳家族蛋白(PcG)中具有催化活性的亞基，果蠅zeste基因增強子的人類同源基因2(EZH2)是主要起組蛋白甲基轉移酶的作用，通過甲基化修飾核小體組蛋白H3K27位點賴氨酸調節(jié)細胞分化、增殖及腫瘤的形成[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在多種惡性實體腫瘤如腎癌、肺癌及甲狀腺癌遷移及預后差相關[5-7]，且有研究報道EZH2抑制劑在體外有抗白血病作用[8]。但是EZH2在白血病的作用及其參與EMI的機制研究較少。本課題前期研究證實人APL細胞系HL-60和Kasumi-1細胞均高表達EZH2，且已通過實驗證實在Kasumi-1 細胞株中EZH2促進其細胞遷移、增殖，抑制其凋亡[9]。本研究旨在探究EZH2對HL-60細胞遷移、增殖能力的影響及可能的機制，以為APL的表觀遺傳學治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

55例初治AML患者骨髓單個核細胞標本來源于南方醫(yī)院血液科。HL-60細胞購自天津血液病研究所。細胞的培養(yǎng)基為含有10%新生牛血清(杭州四季青公司，中國)的RPIM-1640培養(yǎng)基(Hyclone,USA)，并添加100 U/L青霉素、100 μg/L 鏈霉素；在含有37 ℃、5% CO2飽和濕度條件進行培養(yǎng)。RNA 提取試劑Trizol試劑盒及逆轉錄試劑盒均購自中國TaRaRa公司。EZH2和β-actin基因引物均由上海英俊捷基公司設計并合成。核蛋白/胞漿蛋白試劑盒購自中國弗德生物公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)單抗、EZH2單抗、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)單抗、H3K27me3單抗、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)單抗、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)單抗、GAPDH單抗均購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液購自中國DAKO公司。能夠敲除EHZ2的3種不同序列小干擾RNA(siRNA-1:AAC AGC TGC CTT AGC TTC A,siRNA-2:AAC AGC TCT AGA CAA CAA A,siRNA-3:GGA TAG AGA ATG TGG GTT T) 及對照組空病毒(NC：TTC TCC GAA CGT GTC ACG T)購自中國吉凱基因。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測EZH2表達

qRT-PCR方法檢測AML患者骨髓EZH2 mRNA的表達水平，并分析其表達與臨床特征的關系。

1.2.2建立敲除EZH2的HL-60細胞株

6孔板接種對數(shù)生長期的HL-60細胞，使每個孔細胞數(shù)為1×105個，HL-60細胞分別用3種不同序列siRNA的慢病毒(分別為siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組)及空載體慢病毒(為NC組，而未轉染的HL-60則為wild組)轉染，培養(yǎng)72 h后在熒光顯微鏡下拍照。隨后流式細胞術用來檢測細胞的綠色熒光蛋白(GFP)轉染率，并篩選出GFP陽性的細胞，用qRT-PCR及Western blot驗證3個不同序列的siRNA敲除EZH2的效果并篩選出最佳序列記為siEZH2組，體外擴大培養(yǎng)。

1.2.3Transwell實驗檢測細胞遷徙能力

細胞的遷移能力用Transwell遷移小室實驗來檢測，小室基底膜的孔徑為8 μm。HL-60的3個處理組細胞株(wild、NC和siEZH2組)，用磷酸緩沖鹽溶(PBS)分別洗滌細胞2次，RPIM-1640培養(yǎng)基重懸細胞使細胞濃度為3×106個/L。分別取3×105個細胞接種到Transwell小室的上室。下室加入500 μL各自細胞所需含有血清的正常培養(yǎng)基，在含有37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)18 h后，對遷移到下室的細胞進行計數(shù)。同上處理各組細胞，培養(yǎng)時間為10 h。取出小室，用蘇木素對小室膜上細胞進行染色，選擇相同位置的5個視野進行計數(shù)并拍照。上述實驗均重復3次。

1.2.4CCK8檢測細胞增殖活性

CCK8實驗用來檢測細胞的增殖活性，將HL-60的wild、NC、siEZH2 3組對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板，調整每孔細胞數(shù)為1×104個，各組設3個復孔。分別于0、24、48、72、96 h后加入CCK8試劑，培養(yǎng)3 h后在酶標儀下測定各孔450 nm吸光度(A)值，以上試驗重復3次。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡

細胞凋亡用細胞凋亡雙標檢測試劑盒膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-APC/PI)檢測，用PBS液漂洗wild、NC、siEZH2 3組細胞，1×Binding Buffer漂洗細胞1次離心棄上清液，隨后用100 μL 1×Binding Buffer重懸3組細胞，加5 μL Annexin V-APC，室溫光孵育15 min。1×Binding Buffer漂洗細胞1次之后離心棄上清液，在200 μL 1×Binding Buffer重懸的3組細胞中加入5 μL PI；用流式細胞儀來檢測細胞凋亡。

1.2.6qRT-PCR及Western blot方法檢測相關基因及蛋白表達

采用qRT-PCR方法檢測相關基因表達，具體方法同本課題組前期研究[10-11]。Western blot方法用來測定相關蛋白，取HL-60的wild、NC、siEZH2 3組細胞提取蛋白，蛋白濃度用二喹啉甲酸(BCA)法檢測，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)之后轉膜，加入一抗在4 ℃冰箱孵育過夜，次日洗膜之后加入二抗孵育2 h。以GAPDH為內參，化學發(fā)光顯色后拍照分析EZH2、組蛋白H3第27位賴氨酸上三甲基化(H3K27me3)、MMP-2及E-cadherin蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 AML患者EZH2表達水平與臨床特征的關系

55例AML患者EZH2表達與臨床特征的關系,在AML中高表達EZH2患者EMI發(fā)生率明顯升高(P<0.01)，見表1。

表1 AML患者EZH2表達與臨床特征關系

續(xù)表1 AML患者EZH2表達與臨床特征關系

2.2 各組細胞EZH2的表達水平比較

在HL-60細胞中轉染載有不同siRNA片段的慢病毒，培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下拍照，見圖1。qRT-PCR及Western blot檢測EHZ2基因及蛋白表達均下調。siRNA-1組EZH2 mRNA(0.003 0±0.000 2)明顯低于siRNA-3組(0.004 3±0.000 1)和siRNA-2組(0.006 4±0.000 6)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。 其中以siRNA-1(序列AAC AGC TGC CTT AGC TTC A)下調HL-60細胞的EZH2最明顯，Western blot檢測結果與PCR結果一致，流式篩選siRNA-1組GFP陽性細胞體外擴大培養(yǎng)用于后續(xù)實驗,隨后檢測NC、siEZH2、wild 3組細胞EZH2的表達，qRT-PCR及Western blot結果均顯示，siEZH2組EZH2表達均明顯低于NC組及wild組(P<0.001)，見圖2。

A:siRNA-1組；B:siRNA-2組；C:siRNA-3組。

a：P<0.001,與wild組比較；bP<0.001，與siRNA-1組比較。

2.3 各組HL-60細胞增殖活性及凋亡率比較

CCK8實驗提示在HL-60細胞中敲除EZH2后siEZH2組的增殖能力明顯下降(P<0.05)。通過流式細胞術檢測細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)siEZH2組細胞凋亡明顯增加(P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與siEZH2組比較。

2.4 各組HL-60細胞敲除EZH2后細胞遷移能力比較

Transwell遷移實驗中siEZH2組的下室細胞比例[(4.50±0.26)%]明顯低于wild組[(9.05±0.30)%]和NC組[(9.03±0.27)%]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；蘇木素染色后發(fā)現(xiàn)siEZH2組小室膜上細胞基數(shù)比wild組和NC組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)，見圖4。

a:P<0.001,與siEZH2組比較。

2.5 各組HL-60細胞敲除EZH2后H3K27me3和MMP-2蛋白水平比較

在HL-60細胞中敲除EZH2，H3K27me3和MMP-2蛋白均明顯下調(P<0.05)，而E-cadherin則上調(P<0.05)，同時發(fā)現(xiàn)EZH2下調后抗凋亡蛋白Bcl-2亦下調,而細胞凋亡途徑關鍵蛋白caspase-3上調，見圖5。

圖5 Western blot檢測相關蛋白表達

3 討 論

EZH2作為PcG蛋白家族成員之一，在多種腫瘤中起原癌基因作用。EZH2參與調節(jié)細胞分化、增殖及腫瘤的形成[3],有研究顯示EHZ2與多種實體腫瘤遷移能力相關[5-7]。APL為白血病中一種特殊類型，EMI發(fā)生率較高，EMI中以中樞浸潤較常見，一旦發(fā)生中樞侵犯預后較差。目前國內外有關APL與EZH2的關系及其EMI機制研究極少。本課題組前期研究已證實在AML細胞株HL-60及Kasumi-1存在EZH2高表達，且在Kassumi-1細胞中證實敲除EZH2細胞凋亡增加，增殖減慢，機制研究顯示EZH2通過調控E-cadherin蛋白及p-ERK/p-cmyc/MMP-2通路影響細胞遷移[9-10]。且TANAKA等[11]研究顯示，在HL-60細胞中下調EZH2可抑制其增殖。因此，本研究猜測EZH2與APL細胞增殖、凋亡及遷移相關。本研究旨在探究在HL-60中敲除EZH2對細胞的增殖、凋亡及遷移的影響及其可能的機制。

相對于實體腫瘤的遷移而言，在白血病中則表現(xiàn)為EMI，白血病一旦發(fā)生EMI則預后較差。MMPs、黏附分子、趨化因子及E-cadherin異常表達均可影響白血病細胞EMI。當骨髓中白血病細胞表面的黏附因子表達異常時其黏附能力下降促使細胞趨化黏附于血管內皮上，進而分泌MMPs促使細胞外基質降解，最終細胞遷移至骨髓外導致EMI[12-14]。相關研究表明，在AML中EMI的發(fā)生亦與MMPs表達增加密切相關[15-16]。EZH2可通過甲基化腎癌、口腔癌細胞核小體組蛋白下調E-cadherin表達從而增強細胞的轉移能力[5，17]。本研究結果顯示，在HL-60細胞中敲除EZH2后E-cadherin表達上調，MMP-2下調，細胞遷移能力減弱。因此，本研究認為EZH2可能通過上調HL-60細胞的MMP-2降解細胞外基質或通過下調E-cadherin來增強APL細胞遷移能力。

EZH2主要通過甲基化周期蛋白、抑癌基因等靶基因參與調節(jié)細胞分化增殖及腫瘤的形成[4]。林璐慧等[18]研究發(fā)現(xiàn)，敲除EZH2后HL-60細胞中H3K27me3亦下調從而導致Bcl-2下調促進細胞凋亡。Bcl-2是一種癌基因，具有抑制凋亡的作用。有研究報道，在HL-60細胞存在Bcl-2過表達，抑制Bcl-2的表達能夠增加細胞凋亡關鍵基因caspase-3活性，進而抑制細胞增殖并促進其凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲除EZH2后HL-60細胞的增殖減弱、凋亡增加。本研究認為，敲除EZH2后對組蛋白 H3K27的甲基化作用減弱，進而其對靶基因抑制作用減弱，從而引起B(yǎng)cl-2下調及caspase-3上調。

綜上所述，EZH2可能通過上調Bcl-2及下調caspase-3促進HL-60細胞增殖并抑制其凋亡。臨床中使用去甲基化藥物如地西他濱及阿扎胞苷治療白血病可能基于表觀遺傳學調控，這為將來使用EZH2抑制劑或其他類型去甲基化藥物治療白血病提供一定理論基礎，更深的機制研究仍需進一步探究。在APL細胞株(HL-60)中敲除EZH2能有效抑制其增殖和遷移能力,并促進其凋亡，且EZH2可能通過MMP-2及E-cadherin影響HL-60細胞的遷移能力,EZH2可能通過調節(jié)Bcl-2及caspase-3影響HL-60細胞增殖凋亡，這將為APL表觀遺傳學治療提供新靶點。