卞敬琦，張玉昆，馮月男，牛雯穎

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，哈爾濱 150040)

高脂血癥是誘發(fā)動脈粥樣硬化、血栓的主要因素，嚴(yán)重威脅人類健康。血脂異常可損傷血管壁內(nèi)皮細(xì)胞，促使血小板黏附、聚集和釋放，從而引起血小板活化。補(bǔ)陽還五湯具有抗動脈粥樣硬化、改善血流動力學(xué)、降血脂、抗血小板活化等作用，至今已沿用百年，是治療卒中之氣虛血瘀證的名方。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)信號通路廣泛調(diào)控細(xì)胞功能，有報道顯示，抑制Class IA PI3K信號通路可明顯降低小鼠游離脂肪酸(FFA)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)水平[1]，故本實(shí)驗(yàn)以黏附斑激酶(FAK)-PI3K-AKT信號通路為切入點(diǎn)，對補(bǔ)陽還五湯對高脂血癥模型大鼠作用機(jī)制進(jìn)行研究，以期探討潛在作用靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥治療高脂血癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物

選取清潔級健康SD大鼠50只，雄性，體重(235.4±10.6)g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證號SCXK(黑)2013-001)。

1.1.2藥品與試劑

補(bǔ)陽還五湯藥物組成：黃芪120 g，歸尾6 g，赤芍5 g，地龍3 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g；辛伐他汀片購自哈藥集團(tuán)三精明水藥業(yè)有限公司(批號：201706001，規(guī)格：10 mg)；TC、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、TG試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(批號：182022、180671、187831)；全蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、一抗二抗去除液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠快速制備試劑盒、Western洗滌液、SDS-PAGE電泳液(干粉)、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液、FAK、Syk、磷酸化蛋白激酶B[p-AKT(Ser473)]、磷脂酰肌醇激酶β抗體(PI3Kp110β)、羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)、內(nèi)參抗體均購自中國萬類生物科技有限公司(貨號：WLA019、WLA004、WLA007、WLA013、WLA025、WLA026、WLA005、WLA003、WL03550、WL02427、WLP001a、WL03380、WLA023、WL01845)；預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自加拿大富酶泰斯生物技術(shù)有限公司(貨號：26616)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國默克公司(貨號：IPVH00010)；牛血清清蛋白(BSA)購自白鯊生物科技(中國)有限公司(貨號：BS043)；4-磷酸-磷脂酰肌醇-5-激酶(PIP5K)、脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(貨號:13361-1-AP、55190-1-AP)；磷酸化蛋白激酶1/2/3抗體[p-AKT1/2/3(Thr308)]購自親科生物(中國)公司(貨號：AF3262)；脫脂奶粉購自內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司(貨號：Q/NYLB 0039S)。

1.1.3儀器

WD-9405B水平搖床、DYY-7C電泳儀、DYCZ-40D轉(zhuǎn)移槽購自北京六一生物科技有限公司；Proline微量移液器購自百得實(shí)驗(yàn)室(中國)有限公司；NW10LVF超純水系統(tǒng)購自力康生物理療科技控股有限公司；H-2050R超速冷凍離心機(jī)購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；ELX-800酶標(biāo)儀購自美國伯騰儀器有限公司；DH36001B電熱恒溫培養(yǎng)箱購自天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)造模及動物分組、給藥方法

將50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，10只大鼠喂食基礎(chǔ)飼料(空白組)，40只大鼠喂食高脂飼料(基礎(chǔ)飼料+15%豬油+20%蔗糖+1.2%膽固醇+0.2%膽酸鈉)，正常飲水、自由進(jìn)食。于第4周開始檢測動物血脂水平，確認(rèn)高脂血癥模型動物造模成功后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將40只高脂血癥模型大鼠分為4組，即補(bǔ)陽還五湯高劑量組(高劑量組，生藥14.0 g/kg)、補(bǔ)陽還五湯低劑量組(低劑量組，生藥3.5 g/kg)、辛伐他汀對照組(對照組，0.004 g/kg)和模型組，每組10只?？瞻捉M繼續(xù)伺以普通飼料，其他組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。各給藥組灌服相應(yīng)藥物，空白組和模型組灌服等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)4周。

1.2.2檢測指標(biāo)

(1)血脂測定：腹主動脈取血，取枸櫞酸鈉抗凝血3 mL，3 000 r/min離心10 min，分離上層血漿，按照TC、TG、LDL-C試劑盒說明書，利用全自動生化分析儀操作。(2)Western blot檢測相關(guān)信號通路中相關(guān)蛋白：根據(jù)每個樣本的質(zhì)量和體積的不同加入不同體積的裂解樣本，然后將其繼續(xù)放置于冰上裂解5 min，離心(12 000 r/min，4 ℃，10 min)，棄上清液獲得蛋白質(zhì)抽提物，用5×Loading Buffer和磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋蛋白樣品，在沸水浴中煮沸5 min，制成上樣液備用。本次實(shí)驗(yàn)的上樣體積20 μL，含30 μg蛋白。將蛋白樣本進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)印、封閉后，加入對應(yīng)的一抗FAK(1∶500)、Syk(1∶500)、PIP5K(1∶500)、PI3Kp110β(1∶500)、p-AKT(Ser473)(1∶500)、p-AKT1/2/3(Thr308)(1∶1 000)、ATGL(1∶1 000)孵育，用TBST洗膜，然后與對應(yīng)的二抗羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)孵育45 min，洗膜。用ECL底物發(fā)光，用凝膠成像分析目標(biāo)條帶的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血脂水平比較

與空白組比較，模型組大鼠血漿TC、TG和LDL-C水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，高、低劑量組和對照組大鼠血漿TC、TG和LDL-C水平明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血脂水平比較

2.2 各組大鼠相關(guān)蛋白水平比較

與空白組比較，模型組中蛋白FAK、PIP5K、PI3Kp110β、p-AKT1/2/3(Thr308)、p-AKT(Ser473)、 ATGL均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，低劑量組和對照組均抑制了該信號通路蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組明顯抑制蛋白FAK和ATGL的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，對于其他蛋白表達(dá)也有抑制作用，但結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖1。

表2 各組大鼠蛋白的相對表達(dá)水平比較

圖1 各組蛋白條帶圖

3 討 論

高脂血癥是一種脂質(zhì)代謝紊亂性疾病，發(fā)病率逐年攀升，且大多數(shù)患者并無明顯癥狀。有研究指出2010-2030年中國心血管患者將增加920萬，而高脂血癥是其發(fā)病的主要誘因[2]。他汀類藥物是目前廣泛使用的一線降脂藥物，可有效降低LDL和TG水平，所以本研究使用辛托伐他汀作為對照藥物?，F(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)陽還五湯可明顯降低高脂血癥患者血脂水平、改善脂代謝紊亂狀況[3]。補(bǔ)陽還五湯中黃芪含有的黃芪多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及降低血脂的作用[4]；當(dāng)歸中所含的阿魏酸能夠抑制膽固醇的合成及脂質(zhì)在血管中的沉積，從而起到抗動脈粥樣硬化的作用[5]；赤芍提取物能有效調(diào)節(jié)早期糖尿病腎病大鼠脂代謝紊亂水平[6]；地龍中含有的活性肽類—地龍多肽可預(yù)防性降低血脂及肝脂水平，改善脂肪酸代謝異常[7]；并且中藥具有不良反應(yīng)少價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，作為降脂藥物具有廣泛的前景及應(yīng)用市場。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT廣泛參與了高脂血癥的形成和發(fā)展[8]，而抑制FAK蛋白的表達(dá)，能夠降低動脈粥樣硬化斑塊的形成[9]，故本文采用高脂飼料喂養(yǎng)復(fù)制高脂血癥模型大鼠，研究補(bǔ)陽還五湯對FAK-PI3K/AKT信號通路的影響。

TG是哺乳動物的主要能量儲備，而ATGL是一種重要的水解脂肪限速酶，能夠?qū)G水解為二酰甘油(DAG)和FFA[10-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂血癥大鼠血漿中TG水平明顯升高、ATGL的表達(dá)水平明顯上調(diào)，說明高脂血癥模型大鼠存在脂代謝異常狀態(tài)，且體內(nèi)有大量被水解的DAG，蓄積的DAG可以激活蛋白激酶C，促進(jìn)整合蛋白αIIbβ3磷酸化[13-16]，繼而進(jìn)一步引起FAK的磷酸化。高脂血癥形成過程中伴隨著一系列復(fù)雜的細(xì)胞信號調(diào)節(jié)，而FAK在多個信號調(diào)節(jié)扮演著樞紐的角色，F(xiàn)AK磷酸化可導(dǎo)致細(xì)胞黏附和下游靶蛋白的活化，PI3K便是其中之一，PI3K包括p85和p110兩個亞基。研究表明，PI3Kp110β抑制劑或PI3Kp110β有缺陷時，會影響血小板活化并阻止動脈血栓形成[17-20]?；罨腜I3K催化肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)。其中，PIP5K可以產(chǎn)生PIP2，從而為PI3K提供更多的底物。AKT是PI3K下游的重要靶標(biāo)激酶，PIP3可與AKT結(jié)合，將AKT從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜并促進(jìn)Ser473和Thr308在其位點(diǎn)的磷酸化，從而使AKT完全激活。Thr308和Ser473的磷酸化是AKT激活的必要條件，只有激活的AKT才能啟動PI3K/AKT信號傳導(dǎo)途徑，以促進(jìn)下游級聯(lián)反應(yīng)繼續(xù)傳播并發(fā)揮生物學(xué)作用[21]。

綜上所述，本研究從FAK-PI3K-AKT信號通路和對TG水解產(chǎn)生重要影響的水解酶ATGL兩方面對高脂血癥模型大鼠進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，ATGL、FAK-PI3K-AKT通路相關(guān)蛋白在高脂血癥大鼠體內(nèi)呈高表達(dá)狀態(tài)。補(bǔ)陽還五湯干預(yù)治療后，高脂血癥模型大鼠血脂水平明顯降低。(1)補(bǔ)陽還五湯能下調(diào)ATGL蛋白表達(dá)，降低體內(nèi)蓄積的DAG，阻止了FAK的磷酸化；(2)補(bǔ)陽還五湯低劑量組能直接降低FAK-PI3K-AKT通路上關(guān)鍵蛋白Thr308和Ser473的表達(dá)，從而抑制了FAK-PI3K/AKT信號通路的激活，降低了脂質(zhì)形成。本研究內(nèi)容較好地揭示了補(bǔ)陽還五湯防治高脂血癥具有多途徑、多靶點(diǎn)的綜合作用，可為今后高脂血癥臨床用藥提供新的思路和治療依據(jù)。